УЧАСТИЕ ЭСТРАДИОЛА В ОСВОБОЖДЕНИИ СА2+ИЗ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ ДЕПО ООЦИТОВ СВИНЕЙ

В. Ю. ДЕНИСЕНКО, Т. И. КУЗЬМИНА

ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных РАСХН»

Введение. Возможность моделирования условий созревания ооци- тов свиней in vitro позволяет исследовать характер воздействия раз — личных биологически активных веществ, в том числе и стероидных гормонов непосредственно на процесс инициации мейоза, формирова — ние зрелой яйцеклетки и на этой основе создавать модели, адекватно отражающие процессы созревания ооцита in vitro. Подъем концентра — ции цитозольного кальция является фундаментальным механизмом контроля многих форм клеточной активности. При воздействии на

XIX Международная научно-практическая конференция

Жодино – Горки

различные клетки эстрадиол вызывает увеличение концентрации цито — зольного кальция. Стимулированный эстрадиолом вход Са2+ в энтеро — циты и клетки эпителия толстой кишки крыс опосредуется через акти — вацию цАМФ-системы. Эстроген увеличивает в этих клетках концен — трацию цАМФ параллельно с увеличением количества Са2+ [1, 2]. Кроме того, увеличение концентрации цитозольного кальция может происходить за счет образования инозитол-1,4,5-трифосфата и осво — бождения Са2+ из внутриклеточных депо [3].

Цель работы – идентификация механизмов внутриклеточной сиг- нализации, вовлеченных в трансдукцию гормонального сигнала при воздействии эстрадиола на основе исследования флуктуации содержа — ния Са2+ во внутриклеточных депо ооцитов свиней.

Материал и методика исследований. Объектом исследования

служили ооциты свиней породы ландрас, убитых на мясокомбинате. В экспериментах использовали яичники на стадии фолликулярного роста без признаков видимой патологии. Отобранные яичники трижды про — мывали физиологическим раствором и затем выделяли ооциты из фол — ликулов диаметром 3–6 мм. Для работы брали ооциты округлой фор — мы с тонкогранулированной ооплазмой и равномерной по ширине зо — ной пеллюцида. Инкубацию выделенных ооцитов производили в мо — дифицированной среде Дюльбеко в отсутствии 0,9 мМ CaCI2.

Концентрацию кальция во внутриклеточных депо ооцитов свиней

измеряли с помощью флуоресцентного зонда хлортетрациклина (ХТЦ). Предварительно ооциты очищали от клеток кумулюса, затем инкубировали в течение 5 мин при 37 оC в инкубационной среде, со — держащей 40 мкМ ХТЦ. После этого клетки три раза отмывали в ин — кубационной среде и переносили на специальное кварцевое стекло с ячейками объемом 0,05 мл. Зависимую от Са2+ флуоресценцию ХТЦ регистрировали в ооцитах в среде Дюльбеко.

Интенсивность флуоресценции зонда ХТЦ измеряли на флуори- метрической установке, состоящей из люминесцентного микроскопа. Комплекс ХТЦ-Са2+-мембрана возбуждали светом 380–400 нм, флуо — ресценцию регистрировали в области 530 нм. Интенсивность флуорес — ценции измеряли в у. е. Длительность воздействия ультрафиолетового из — лучения на ооциты при проведении измерений не превышала 5 секунд.

Достоверность различия сравниваемых средних значений для 4–5 не-зависимых экспериментов оценивали с помощью t-критерия Стьюдента.

Результаты исследований. Согласно гипотезе Mullaney et al., гуа — нозинтрифосфат образует связь между двумя внутриклеточными депо кальция – рианодинчувствительными и инозитол-1,4,5-чувствитель-

Cовременные тенденции и технологические инновации в свиноводстве

4–6 октября 2012 г.

ными и обеспечивает переход Са2+ из рианодинчувствительных внут — риклеточных депо в инозитол-1,4,5-чувствительные, в результате чего происходит дополнительное освобождение Са2+ из внутриклеточных депо при активации клеток инозитол-1,4,5-трисфосфатом [4]. Сомато — тропин (СТГ) и теофиллин в ооцитах свиней также вызывают освобо — ждение Са2+ из различных внутриклеточных депо: СТГ – из IP3-чувст — вительных, а теофиллин – из рианодин чувствительных внутриклеточ — ных депо [5]. Добавленные отдельно СТГ в концентрации 10 нг/мл или теофиллин в концентрации 10 мМ стимулируют освобождение Са2+ из внутриклеточных депо (рис. 1). Однако при совместном действии СТГ и теофиллина дополнительного освобождения Са2+ из внутриклеточ — ных депо не наблюдали. Отсутствие дополнительного освобождения при совместном действии этих двух соединений, по-видимому, свиде — тельствует об отсутствии связи между внутриклеточными депо каль — ция. Очевидно, что СТГ и теофиллин не обладают способностью обра — зовывать связь между внутриклеточными депо аналогично действию гуанозинтрифосфата.

0,9

0,8

0,7

0,6

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

0

1 2 3 4

Рис. 1. Влияние СТГ и теофиллина на освобождение Са2+

из внутриклеточных депо ооцитов свиней

При активации мейоза в ооцитах происходит возрастание внутрикле — точной концентрации кальция [6]. Увеличение внутриклеточной кон- центрации кальция осуществляется путем входа внеклеточного кальция внутрь клетки, а также вследствие освобождения Са2+ из внутриклеточ — ных депо. Ранее показано, что добавление эстрадиола в среду культиви — рования увеличивало процент созревших клеток и повышало их качест — во [7]. В настоящем исследовании обнаружено, что воздействие эстра-

0,9

0,8

0,7

0,6

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

0

1 2 3 4

Рис. 1. Влияние СТГ и теофиллина на освобождение Са2+

из внутриклеточных депо ооцитов свиней

При активации мейоза в ооцитах происходит возрастание внутрикле — точной концентрации кальция [6]. Увеличение внутриклеточной кон- центрации кальция осуществляется путем входа внеклеточного кальция внутрь клетки, а также вследствие освобождения Са2+ из внутриклеточ — ных депо. Ранее показано, что добавление эстрадиола в среду культиви — рования увеличивало процент созревших клеток и повышало их качест — во [7]. В настоящем исследовании обнаружено, что воздействие эстра-

XIX Международная научно-практическая конференция

Жодино – Горки

диола в концентрации 1 мкг/мл стимулировало в ооцитах свиньи осво — бождение Са2+ из внутриклеточных депо (рис. 2).

0,7

0,6

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

0

1 2 3 4 5 6 7 8

Рис. 2. Влияние ингибитора нокодазола и АДФ на стимулированное совместным действием СТГ и теофиллина освобождение Са2+

из внутриклеточных депо ооцитов свиньи

По оси абсцисс: 1 – контрольные ооциты; 2 – активация СТГ в кон — центрации 10 нг/мл; 3 – 10 мМ теофиллина; 4 – совместное действие СТГ и теофиллина. По оси ординат – интенсивность флуоресценции ХТЦ, у. е. Различия достоверны при P<0,001 (1 и 2; 1 и 3).

По оси абсцисс: 1 – необработанные эстрадиолом ооциты; 2 – кон — троль (обработанные эстрадиолом ооциты); 3 – активация СТГ в кон- центрации 10 нг/мл; 4 – 10 мМ теофиллина; 5 – совместное действие СТГ и теофиллина; 6 – действие 10 мкМ нокодазола и последующее

совместное действие СТГ и теофиллина; 7 – действие АДФ в концен — трации 1 мМ и последующее совместное действие СТГ и теофиллина;

8 – действие АДФ и ГДФ в концентрации 100 мкМ и последующее со-вместное действие СТГ и теофиллина. Со 2 по 8 столбик ооциты обра — ботаны эстрадиолом. По оси ординат – интенсивность флуоресценции ХТЦ, у. е. Различия достоверны при: P<0,001 (1 и 2; 3 и 5; 5 и 6; 5 и 8), P<0,01 (4 и 5).

При совместном действии СТГ и теофиллина в присутствии эстра — диола отмечали выход Са2+ из внутриклеточных депо. Обработка ооцитов ингибитором полимеризации микротрубочек нокодазолом (10 мкМ) отменяла освобождение Са2+ из внутриклеточных депо, сти — мулированное совместным действием СТГ и теофиллина. Следующим

Cовременные тенденции и технологические инновации в свиноводстве

4–6 октября 2012 г.

этапом в исследовании механизмов трансдукции при воздействии эст — радиола явилась проверка гипотезы о вовлечении ГТФ в образование связи между различными внутриклеточными депо. ГТФ в клетках не — обходим для полимеризации тубулина, структурного элемента микро — трубочек [8]. Для того чтобы ограничить действие ГТФ, в среду инку — бации к ооцитам добавляли ГДФ (предшественника ГТФ) в высокой концентрации (100 мкМ), который ингибирует действие ГТФ. Фер — мент, стимулирующий превращение ГДФ в ГТФ, ингибировался в присутствии АДФ [9]. Добавленный отдельно АДФ не оказывал влия — ния на освобождение Са2+, стимулированное совместным действием СТГ и теофиллина. В то же время совместное действие АДФ и ГДФ отменяло освобождение Са2+, стимулированное при использовании СТГ и теофиллина.

Заключение. Таким образом, в работе на основе ингибиторного анализа показано, что эстрадиол способствует образованию связи ме — жду IP3- и рианодинчувствительными внутриклеточными депо кальция в ооцитах свиней. В обеспечении стимулированного эстрадиолом пе — рехода Са2+ участвуют микротрубочки и ГТФ.

ЛИТЕРАТУРА

1. Acute stimulation of intestinal cell calcium influx induced by 17 beta-estradiol via the cAMP messenger system / G. Picotto [et al.] // Mol. Cell. Endocrinol. – 1996. – Vol. 119. – P. 129–134.

2. Rapid non-genomic activation of cytosolic cyclic AMP-dependent protein kinase activi — ty and [Ca2+](i) by 17beta-oestradiol in female rat distal colon / C. M. Doolan [et al.] // Br. J. Pharmacol. – 2000. – Vol. 129. – P. 1375–1386.

3. A new, nongenomic estrogen action: the rapid release of intracellular calcium / P. Mor — ley [et al.] // Endocrinology. – 1992. – Vol. 131. – P. 1305–1312.

4. Intracellular calcium uptake activated by GTP. Evidence for a possible guanine nucleo — tide-induced transmembrane conveyance of intracellular calcium / J. M. Mullaney [et al.] // J. Biol. Chem. – 1987. – Vol. 262. – P. 13865–13872.

5. Д е н и с е н к о, В. Ю. Эффект соматотропина на выход Са2+ из внутриклеточных депо ооцитов свиней / В. Ю. Денисенко, Т. И. Кузьмина // Генетика и селекция в живот-новодстве: вчера, сегодня, завтра: cб. науч. тр. – СПб., 2010. – С. 212–215.

6. Cortical granule translocation during maturation of starfish oocytes requires cytoskeletal rearrangement triggered by InsP3-mediated Ca2+ release / I. Santella [et al.] // Exp. Cell Res. –

1999. – Vol. 248. – P. 567–574.

7. Эффекты пролактина в различных системах культивирования на созревание ооци — тов коров и их способность к дальнейшему развитию / Т. И. Кузьмина [и др.] // Онтоге — нез. – 2001. – Т. 32. – № 2. – С. 140–147.

8. T i m a s h e f f, S. N. In vitro assembly of cytoplasmic microtubules / S. N. Timasheff, L. M. Grisham // Annu. Rev. Biochem. – 1980. – Vol. 49. – P. 565–591.

9. K i m u r a, N. GDP does not mediate but rather inhibits hormonal signal to adenilate cyclase / N. Kimura, N. Shimada // J. Biol. Chem. – 1983. – Vol. 258. – P. 2278–2283.

XIX Международная научно-практическая конференция

Жодино – Горки

Материал взят из: Современные тенденции и технологические инновации в свиноводстве: матер. XIX Международной науч.-практ. конф Горки, 4–6 октября 2012 г.