СПОСОБ НЕИНВАЗИВНОЙ КОРРЕКЦИИ МЕМБРАННОГО ПОТЕНЦИАЛА КЛЕТОК КРОВИ

П. В. Некрасов

Научный руководитель: канд. техн. наук, доц. П. Т. Харитонов

Пензенская государственная технологическая академия, г. Пенза

Введение. На сегодняшний день, постоянное воздействие на орга низм химических, биологических и физических факторов окружающей среды, а так же вредные привычки оказывают негативное влияние на ор ганизм человека, создавая условия для сдвига концентрации ионов

натрия, калия, приводя к возникновению алкалоза, ацидоза и ряду дру гих заболеваний. [3]

Важную функцию при становлении кислотнощелочного и ионного балансов выполняет мембранный потенциал клеток крови, который складывается из токов, воздействующих на поверхность клетки.

Мембраны – неотъемлемая часть клетки живого организма. Кровь человека состоит на 4045% из форменных элементов, наличие которых

определяет еѐ плотность и вязкость. Внутри клеток крови содержатся положительно и отрицательно заряженные частицы, которые так же вносят свой вклад в определение мембранного потенциала. Поверх ностный слой клеток крови имеет отрицательный заряд, что служит причиной отталкивания их друг от друга [1].

Активные свойства мембраны, обеспечивающие возникновение по тенциалов действия и покоя основываются главным образом на разности концентраций электролитов снаружи и внутри клетки, которые влияют на поведение потенциалзависимых натриевых и калиевых каналов. Потенциал мембраны может изменяться под действием различных сти мулов. В естественных условиях стимулом часто служит химический сигнал от соседних клеток, поступающий через синапс или путѐм диф фузной передачи через межклеточную среду [2].

В связи со сложившейся ситуацией стал актуальным поиск спосо бов коррекции содержания ионов натрия и калия, а так же кислотнощелочного баланса крови и устранение заболеваний, зависящих от дан ных факторов при минимальных затратах и значительной скорости пу тѐм неинвазивного воздействия.

Цель работы. Разработка способа коррекции ионного содержания

натрия, калия и кислотнощелочного баланса крови путѐм неинвазивно го воздействия переменным током в определѐнных интервалах и после дующее внедрение данного метода воздействия.

Материал и методы. Потенциал покоя для большинства мембран составляет величину порядка − 70 мВ, при этом в открытом состоянии

находятся потенциалзависимые калиевые каналы. При потенциале действия заряд достигает значения до 30 мВ, что обеспечивает открытие потенциалзависимых натриевых каналов [2]. Таким образом, пере пад на поверхности мембраны клетки приблизительно будет составлять

±100 мВ. Зная величину потенциалов покоя, действия и сопротивление кожного покрова, можно установить силу тока, действующую на поверх ность мембран клеток крови.

Сила тока при потенциале действия и покоя:

3

 100 *10

 500

где 200*106 – сила тока, ампер;

 200 *106

±100*103 – напряжение, создаваемое на поверхности мембран кле ток крови, в зависимости от еѐ кислотнощелочного баланса, вольт;

~500 – сопротивление увлажнѐнной кожи и тканевой жидкости, ко торое в зависимости от физиологических особенностей организма чело века колеблется от 300 до 1000 Ом.

Искусственно изменяя силу тока, действующую на поверхности мембран, можно контролировать поступление и выведение из клетки катионов натрия и калия, а в результате этого и воды. Причѐм ток, пода ваемый на поверхность мембраны, должен быть биологически совме стимым с ней, в избегании электрического и механического пробоя мем браны, а так же должен учитывать сопротивление кровеносной системы

и кожного покрова, которые при увлажнении колеблются от 300 Ом до

1000 Ом, в зависимости от физиологических особенностей организма человека.

Быстрое движение крови по артериям, венам и капиллярам позволит эффективно воздействовать на неѐ переменным током, изменяя мембранный потенциал клеток крови.

Таким образом, целесообразно создавать силу тока от 100 мкА до

330 мкА (в зависимости физиологии организма) для изменения потенци ала клеток крови. Такая же сила тока создаѐтся и в самом организме,

поэтому воздействие такой силой тока на организм будет безопасным.

Для осуществления возможности такого рода воздействия был сконструирован прибор, создающий нужную силу тока.

Прибор содержит: накладные электроды; регулируемый задатчик тока через участок с прохождением кровеносных сосудов; регулируемый инфранизкочастотный автогенератор; индикатор тока коррекции; переключатель режима работы; переключатель предела измерения индика тора тока; кнопка инверсии тока коррекции; корпус с источником посто янного напряжения 9V.

Накладные электроды размещают на теле таким образом, чтобы короткий путь протекания тока коррекции пролегал через выбранный

для этого кровеносный сосуд. Предпочтительно двусторонне размеще ние электродов, например, на шее или руке (ноге).

Исследование эффективности данного метода проводилось по двум направлениям: на 20 пробах крови и на группе добровольцев, со стоящей из 40 человек.

Исследование влияния переменных сил тока на предварительно отобранные 20 образцов крови производилось в течении 0,5 минуты, по отношению к 5 мл крови.

Так как сопротивлением жидкости воздействию переменного тока можно пренебречь, то сила тока, воздействующий напрямую на кровь

будет составлять примерно ±100мВ.

До и после исследования производился контроль концентраций содержания ионов натрия и калия в плазме крови, для установления влияния данных сил тока на кровь.

Для провидения исследования по второму направлению было при глашено 40 добровольцев. У двадцати человек имелись признаки аци доза, а у остальных алкалоза.

Перед началом исследования был проведѐн опрос добровольцев,

на выявление факторов смещения кислотнощелочного баланса в ту или иную сторону, а также был произведѐн анализ рН мочи каждого добро вольца, стандартным рН метром и определено количественное содер жание натрия и калия перед проведением исследования.

Воздействие на мембранный потенциал клеток крови производи лось поверхностно, на предварительно увлажнѐнные участки кожи, от 40

секунд до 5 минут (в зависимости от места приложения) данным прибо ром. Сила заряда завесила от кислотнощелочного и ионного сдвига в организме. При ацидозе воздействие на кровь осуществлялось положи тельным полюсом напряжения, создаваемое силой тока в 200 мкА, а при алкалозе – отрицательным полюсом, с силой тока в 200 мкА.

В результате воздействия сил тока на мембранный потенциал кле ток крови, происходил выход ионов калия или натрия из эритроцитов в

плазму крови. Избыток ионов удалялся из организма через почки с мо чой, что привело к изменению содержания исследуемых элементов и рН

в моче и крови соответственно.

Впоследствии были произведены повторные анализы количествен ного содержания ионов натрия, калия, рН в моче добровольцев и образ цах крови в пробирках, для установления влияния сил тока на организм.

Результаты и обсуждение. В процессе обработки полученных ре зультатов были определены среднеарифметические показатели полу ченных результатов.

В 20 пробах крови, после еѐ разделения на плазму и форменные элементы, и последующее исследование перехода ионов из клеток крови в плазму и наоборот, обнаружились следующие перепады концен трации ионов натрия и калия в плазме крови:

при воздействии на кровь силой тока в 100мА создаваемой поло жительным полюсом происходил вход ионов натрия из плазмы внутрь клетки;при воздействии на кровь силой тока в 100мА создаваемой от рицательным полюсом происходил вход ионов калия из плазмы внутрь клетки.

Данная закономерность отмечалось при сопоставлении первоначальных и конечных результатах исследования полученных образцов плазмы.

Концентрация ионов натрия, калия и рН мочи у 40 человек, прини мавших участие в исследовании, менялась следующим образом:

У добровольцев, с признаками ацидоза и имеющих среднее значе ние рН мочи 5,1 до проведения воздействия, произошла его увеличение на 0,6. А у добровольцев, с признаками алкалоза и имеющих среднее значение рН мочи 7,5 произошло его уменьшение на 0,9.

Так же произошла стабилизация концентраций содержания ионов натрия и калия в моче после проведения воздействия:

У добровольцев, имеющих признаки ацидоза произошла стабилизация концентрации ионов: натрия на 8ммоль/л., калия на 21ммоль/л.; при признаках алкалоза произошла стабилизация концентрации ионов: натрия на 9ммоль/л., калия на 5ммоль/л.

Наряду с коррекцией содержания ионов натрия и калия происходили изменения, связанные с изменением концентрации данных ионов в плазме крови и моче.

Подобное изменение концентраций элементов в моче и крови до казывает положительное влияние сил тока на организм.

Выводы:

1. Полученные результаты позволят не только нормализовать кис лотнощелочной баланс и целенаправленно его смещать, но также кон тролировать выведение из организма определѐнных электролитов, что важно при заболеваниях мочевыделительной системы.

2. Использование данной методики позволит бороться с послед ствиями приѐма алкогольных напитков среди населения, за счѐт удаления лишних ионов калия, так как при хроническом алкоголизме содержа ние ионов калия в эритроцитах повышается на 20%, а содержание ионов натрия в них снижается в 3,5 раза. Стабилизировать давление станет возможно за счѐт действия свободных ионов натрия, которыѐ при избытке способствуют повышению, а при недостатке – понижению давле ния.

3. Стабилизация мембранного заряда клеток крови будет препят ствовать их склеиванию. Уменьшить риск возникновения онкологических заболеваний, атеросклероза и тромбоэмболии становится возможным

изза нейтрализации ацидоза, который активно способствует развитию такого рода заболеваний.

4. Способ коррекции мембранного потенциала клеток крови умень шает признаки алкалоза и ацидоза, а так же позволяет предупредить остальные проблемы, связанные с изменением ионного баланса крови без применения лекарственных форм.

Данный метод воздействия может быть использован в эксперимен те и клинике при изучении процессов лечения патологий, связанных с

нарушениями кислотнощелочного равновесия в организме, а так же в лечебных и профилактических целях.

Предлагаемый прибор воздействует на кровеносную систему орга низма переменной силой тока, что позволяет увеличить диапазон режи

мов воздействия устройства с учетом индивидуальных показателей функционального соя из плазмы внутрь клетки.

Данная закономерность отмечалось при сопоставлении первоначальных и конечных результатах исследования полученных образцов плазмы.

Концентрация ионов натрия, калия и рН мочи у 40 человек, прини мавших участие в исследовании, менялась следующим образом:

У добровольцев, с признаками ацидоза и имеющих среднее значе ние рН мочи 5,1 до проведения воздействия, произошла его увеличение на 0,6. А у добровольцев, с признаками алкалоза и имеющих среднее значение рН мочи 7,5 произошло его уменьшение на 0,9.

Так же произошла стабилизация концентраций содержания ионов натрия и калия в моче после проведения воздействия:

У добровольцев, имеющих признаки ацидоза произошла стабилизация концентрации ионов: натрия на 8ммоль/л., калия на 21ммоль/л.; при признаках алкалоза произошла стабилизация концентрации ионов: натрия на 9ммоль/л., калия на 5ммоль/л.

Наряду с коррекцией содержания ионов натрия и калия происходили изменения, связанные с изменением концентрации данных ионов в плазме крови и моче.

Подобное изменение концентраций элементов в моче и крови до казывает положительное влияние сил тока на организм.

Выводы:

1. Полученные результаты позволят не только нормализовать кис лотнощелочной баланс и целенаправленно его смещать, но также кон тролировать выведение из организма определѐнных электролитов, что важно при заболеваниях мочевыделительной системы.

2. Использование данной методики позволит бороться с послед ствиями приѐма алкогольных напитков среди населения, за счѐт удаления лишних ионов калия, так как при хроническом алкоголизме содержа ние ионов калия в эритроцитах повышается на 20%, а содержание ионов натрия в них снижается в 3,5 раза. Стабилизировать давление станет возможно за счѐт действия свободных ионов натрия, которыѐ при избытке способствуют повышению, а при недостатке – понижению давле ния.

3. Стабилизация мембранного заряда клеток крови будет препят ствовать их склеиванию. Уменьшить риск возникновения онкологических заболеваний, атеросклероза и тромбоэмболии становится возможным

изза нейтрализации ацидоза, который активно способствует развитию такого рода заболеваний.

4. Способ коррекции мембранного потенциала клеток крови умень шает признаки алкалоза и ацидоза, а так же позволяет предупредить остальные проблемы, связанные с изменением ионного баланса крови без применения лекарственных форм.

Данный метод воздействия может быть использован в эксперимен те и клинике при изучении процессов лечения патологий, связанных с

нарушениями кислотнощелочного равновесия в организме, а так же в лечебных и профилактических целях.

Предлагаемый прибор воздействует на кровеносную систему орга низма переменной силой тока, что позволяет увеличить диапазон режи

мов воздействия устройства с учетом индивидуальных показателей функционального соых АТФ и НАДН, внутриклеточной локали зацией фермента, конформационной пластичностью и способность формировать димеры в мембране для эффективного транспорта про дукта реакции цАДФР, действием лигандов. Экспрессия АДФ рибозилциклазы/CD38 изменяется в процессе дифференцировки клеток и под действием физиологических и патологических стимулов. В частно сти, нами было показано ранее, что в клетках нейрональной природы ак тивность фермента регулируется за счет активации мускариновых аце тилхолиновых рецепторов и, что гаммаинтерферон оказывает нейро протективное действие на модели острой фокальной ишемии головного мозга при его превентивном внутрибрюшинном введении с растворите лем в течение 3 дней до моделирования ишемии за счет направленного усиления экспрессии CD38 в очаге поражения [2, 5]. Однако, в свете по лучения новых данных о возможных нейротоксичных эффектах гамма интерферона, продуцируемого активированный микроглией при дегене ративных патологиях ЦНС, как и в случае никотинамида, представляет ся познавательным изучение in vitro эффектов высоких дозировок гам маинтерферона, поскольку в протоколах нейропротекции зачастую ис пользуют высокие дозировки нейропротекторов.

Цель исследования. Оценить влияние гаммаинтерферона на ак тивность АДФрибозилциклазы и НАД(Ф)Ноксидазы клеток головного мозга in vitro в физиологических условиях и при ишемии головного мозга.

Материал и методы. Объект исследования – крысысамцы Wistar с моделью глобальной ишемии головного мозга (контрольная группа и 2 группы ишемии). Животные были разделены следующим образом: группа К (контроль) – интактные животные; группа И1 – моделирование ишемии головного мозга с забором материала через 24 часа с момента проведения операции, группа И2 – моделирование ишемии головного мозга с забором материала через 48 часов. Моделирование ишемии осуществлялось анестезированным животным (фторотан ингаляционно) путем экстравазальной билатеральной окклюзии общих сонных ар терий по методу Eklof и Siesjo, 1972 [6]. У животных осуществлялся забор ткани из регионов головного мозга обоих полушарий, предваритель но проведена оценка неврологического дефицита с помощью NSSтеста [1], а также когнитивной дисфункции с помощью теста «Водный лаби ринт Морриса». Смертность животных после проведения операции вы числялась в процентах от общего числа крыс в группе. Детекция экс прессии СD38 клетками нейроглиальной природы проводилась на замороженных срезах лобных долей больших полушарий головного мозга со гласно стандартному протоколу двойного непрямого метода иммуноги стохимии. Люминесцентная микроскопия срезов проводилась при увеличении 900, фотографировались 10 полей зрения. С помощью разрабо

танного программного обеспечения оценивалась относительная пло щадь экспрессии антигена СD38 клетками нейроглиальной природы в процентах от общей площади аутофлуоресцирующих клеток в каждом поле зрения и рассчитывалось среднее значение этого показателя по 10 полям зрения (в %). Модуляция экспрессии CD38 осуществлялась непо средственно между 2 и 3 этапами стандартного иммуногистохимического протокола гаммаинтерфероном (препарат «Ингарон»). В гомогенатах ткани лобных долей больших полушарий головного мозга крыс опреде лена активность АДФрибозилциклазы/CD38 (согласно стандартному протоколу R. M. Graeff и др., в ед/мин/мг белка) и функциональная актив ность клеток нейроглии (главным образом микроглии, активность оцени валась по интегральным кривым кинетики их аутофлуоресценции при длине волны, соответствующей редокстрансформации внутриклеточ ных пиридиновых нуклеотидов по оригинальной методике Салмина А. Б., Салмин В. В., Лопатина О. Л. и др., в отн. ед.) флуориметрическим методом до и после модуляции функциональной активности гамма интерфероном в концентрации 1000 МЕ/1 мл гомогената ткани.

Результаты и обсуждение. Использованные методы оценки неврологического дефицита подтвердили эффективность модели гло бальной ишемии. Смертность животных в данной модели, имитирующей

тяжелые повреждения головного мозга, составляла 50% в обеих группах с моделью ишемии головного мозга, что согласуется с литературными

данными [6]. В контрольной группе смертности крыс не наблюдалось.

Анализ относительной площади CD38позитивных нейроглиальных клеток лобных областей больших полушарий головного мозга на замо роженных срезах в процентах от общей площади нейроглиальных клеток

выявил статистически значимое усиление экспрессии CD38 в клетках нейроглии при глобальной ишемии головного мозга в группах ишемии И1 (25,6±4,17) и И2 (26,0±4,05) в сравнении с группой контроля (16,0±1,8) без приложения модуляторов. Исследование изменения ак тивности АДФРциклазы при развитии глобальной ишемии головного

мозга выявило статистически значимое (p≤0,05) снижение активности этого фермента через 48 часов с момента развития ишемии головного

мозга в группе И2 (0,01±0,002) в сравнении с группой К1 (0,42±0,269) при тенденции к ее снижению через 24 часа с момента развития ишемии (группа И1, 0,04±0,015). Эти данные согласуются с полученными нами ранее данными о динамическом характере изменения активности этого фермента при фокальной ишемии головного мозга у крыс. Характер по степенного снижения активности CD38 при развитии ишемии головного

мозга, несмотря на усиление экспрессии этого фермента, скорее всего, связан с истощением работы фермента и, в целом, истощения функцио нальных ресурсов клеток нейроглии и/или снижением содержания НАД+, наблюдаемым в патогенезе ишемии головного мозга. Усиление экспрес

сии данного фермента, скорее всего, компенсаторная реакция организ ма в ответ на истощение ферментативных клеточных систем, что в условиях истощения внутриклеточного содержания НАД+ еще больше усугубляет истощение его функциональных резервов.

Исследование изменения функциональной активности нейроглии при развитии глобальной ишемии головного мозга выявило закономер ности, сходные с активностью АДФРциклазы клеток: наблюдалось ее снижение как через 24 (группа И1, 0,07±0,016), так и через 48 (группа И2,

0,07±0,019) часов с момента развития ишемии головного мозга в срав нении с группой К1 (0,29±0,182). Снижение функциональной активности клеток нейроглии (главным образом микроглии) согласуется с литературными данными об истощении «фагоцитарного резерва» у части кле токфагоцитов, наблюдаемом в тесте с нитросиним тетразолием, в результате предшествующей пролонгированной активации фермента

НАД(Ф)Ноксидазы.

Приложение гаммаинтерферона к гомогенатам ткани для изучения активности АДФРциклазы во всех группах не вызвало статистически значимых эффектов, наблюдались лишь тенденции к снижению АДФ рибозилциклазной активности CD38 в группе контроля К1 (0,03±0,009) и к ее усилению в группах И1 (0,08±0,051) и И2 (0,03±0,014). При модуляции функциональной активности нейроглии (главным образом клеток микроглии) наблюдалось статистически значимое усиление активности

при приложении гаммаинтерферона в группах И1 (0,31±0,031, p≤0,05 в сравнении со значениями до модуляции) и И2 (0,36±0,101, p≤0,05 в сравнении со значениями до модуляции) и тенденция к ее увеличению в группе К1 (0,66±0,274). Гаммаинтерферон вызвал статистически значимое повышение экспрессии CD38 в группе контроля (49,2±6,75, p≤0,05 в сравнении со значениями до модуляции) и тенденцию к ее повышению в группах И1 (42,9±6,66) и И2 (45,9±11,13), что указывает на возможную роль гаммаинтерферона в регуляции экспрессии АДФРциклазы/НАД+ гликогидролазы/CD38 в физиологических условиях, однако использова ние его как модулятора АДФРциклазной активности при глобальной ишемии головного мозга без проведения дополнительных исследований с использованием больших статистических выборок не целесообразно. Для модуляции функциональной активности клеток нейроглии (главным

образом микроглиальных клеток) при ишемии головного мозга возможно использовать гаммаинтерферон.

Таким образом, получены данные, свидетельствующие об однона правленном снижении активности CD38/АДФрибозилциклазы (при усилении экспрессии CD38) и функциональной активности нейроглии (в ос новном микроглии) при ишемии головного мозга. Гаммаинтерферон может являться in vitro модулятором экспрессии CD38 в физиологиче

ских условиях и активности НАД(Ф)Ноксидазы клеток нейроглии при экспериментальной ишемии головного мозга.

Работа выполнена при поддержке гранта индивидуальных проектов молодых ученых КГАУ «ККФПН и НТД».

Список литературы:

1. Салмина, А. Б. Изменение активности АДФрибозилциклазы в клетках нервной системы коррелирует с развитием постишемической когнитивной дисфункции / А. Б. Салмина, Н. А. Шнайдер, С. В. Михуткина и др. // Международный невроло гический журнал. – 2007. – №1(11). – C. 7178.

2. Фурсов, А. А. Профилактика постишемического неврологического дефицита пу тем модуляции экспрессии АДФрибозилциклазы в клетках головного мозга / А. А. Фурсов, А. Б. Салмина, В. А. Мороз и др. // Общая реаниматология. – 2007. –

Т. 3, № 56. – С. 109113.

3. Brough, D. Ca2+ stores and Ca2+ entry differentially contribute to the release of IL1 beta and IL1 alpha from murine macrophages / D. Brough, R. A. Le Feuvre, R. D. Wheeler et al. // J. Immunol. – 2003. – V. 170, №6. – P. 30293036.

4. Chiozzi, P. Spontaneous Cell Fusion in Macrophage Cultures Expressing High Lev els of the P2Z/P2X7 Receptor / P. Chiozzi, J. M. Sanz, D. Ferrari et al. // J. Cell. Biol.

– 997. – V.138, №3. – P. 697706.

5. Higashida, H. Muscarinic receptormediated dual regulation of ADPribosyl cyclase in NG10815 neuronal cell membranes / H. Higashida, S. Yokoyama, M. Hashii, M. Taketo, M. Higashida, T. Takayasu, T. Ohshima, S. Takasawa, H. Okamoto, and M. Noda // J. Biol. Chem. – 1997. – V. 272. – P. 3127231277.

Материал взят из: Медикобиологические науки: достижения и перспективы (г. Томск, 10-11 ноября 2011 г.): сборник материалов I Всероссийской научной студенческой конференции