ПОЛИФОСФАТЫ ФОТОСИНТЕЗИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ

В настоящее время полифосфаты обнаружены у ряда низших орга5 низмов (бактерии, грибы, водоросли). Подобное изучение обмена по5 лифосфатов, проведенное в ряде лабораторий ((1–3) и др.), показало их важную роль во внутриклеточных превращениях фосфора и в энергетических процессах клетки. В связи с этим особый интерес представляет изучение вопросов о возможном участии полифосфатов в процессе бактериального фотосинтеза. До сих пор по этому вопро5 су нет сколько5нибудь определенных данных, и даже самое наличие полифосфатов в клетках фотосинтезирующих бактерий не доказано. Имеются лишь единичные указания на возможное присутствие поли5 фосфатных гранул у некоторых бактерий этой группы (4–6). Однако эти указания носят характер лишь предварительных предположений, выдвинутых на основании электронно5микроскопического изучения. На каких аналитических данных, подтверждающих наличие поли5 фосфатов у фотосинтезирующих бактерий, в литературе не имеется. Поэтому нами была в настоящей работе предпринята попытка обна5 ружить присутствие полифосфатов у фотосинтезирующих бактерий прямыми химическими методами. Это позволило бы поставить воп5 рос об изучении возможной связи процессов бактериального фото5 синтеза с обменом полифосфатов.

В качестве объекта были взяты чистые культуры представителей

трех различных семейств фотосинтезирующих бактерий: зеленых серобактерий Chlorobium thiosulphatophilum (сем. Chlorobacte5 riaceae), пурпурных серобактерий Chromatium, штамм К (сем. Thiorhodaceae) и пурпурных несерных бактерий Rhodopseudomonas palustris (сем. Athiorhodaceae). Бактерии выращивали в анаэроб5 ных условиях при круглосуточном освещении на синтетических сре5 дах, предложенных для культивирования пурпурных бактерий Ван5Нилем (7) и зеленых серобактерий – Ларсеном (8). Урожай клеток снимали приблизительно в стационарной фазе роста. Не по5 требленные соли среды растворяли путем подкисления соляной кис5 лотой до 0,05 N, после чего бактериальную массу отделяли от среды центрифугированием, промывали дистиллированной водой и в те5 чение 3 часов и фиксировали 96% этанолом. Затем клетки обраба5 тывали смесью спирт5эфир (1:3) в течение 3–4 часов (для удаления основной массы каротиноидных пигментов), 2 раза эфиром и высу5 шивали в вакуум5эксикаторе над серной кислотой. Полученную су5 хую обезжиренную бактериальную массу использовали для анализа.

Ортофосфат определяли по методу Беренблюм и Чейна в модифика5 торе Вейль5Малерба и Грина (9) с небольшими изменениями. Суммар5 ное количество нуклеиновых кислот определяли спектрофотометрически

(10). При анализе бактериальной массы полифосфаты изучали как в кислоторастворимой, так и в кислотонерастворимой фракциях.

Для выделения кислоторастворимой фракции навеску сухих бак5 терий дважды экстрагировали при 0°С 2% хлорной кислотой: пер5 вый раз — в течение часа, второй — в течение 30 мин. Специальные опыты с Chlorobium thiosulphatophilum показали, что экстракция хлорной кислотой более высокой концентрации (6%) вызывает не5 которую деполимеризацию нуклеиновой кислоты (РНК) и ее час5 тичный переход в кислоторастворимую фракцию. Из полученной кислоторастворимой фракции полифосфаты осаждали свежеприго5 товленным раствором насыщенного уксуснокислого бария при рН 4,5. Бариевые осадки отделяли центрифугированием и промы5 вали дистиллированной водой. Нерастворимые бариевые соли по5 лифосфатов переводили в растворимые натриевые соли путем обработки катионитом У52 в Nа—форме. Водный слой с перешед5 шими в него полифосфатами отделяли от смолы центрифугировани5 ем. Смолу промывали дистиллированной водой, и промывные воды присоединяли к основному центрифугату. В полученном растворе весь лабильный фосфор принадлежит полифосфатам. За количе5 ство лабильного фосфора принимали фосфор, гидролизующийся до ортофосфата в течение 75минутного гидролиза в 1 N HCI при 100°С. Последующие 23 мин. гидролиза при тех же условиях служили до5 полнительным контролем на полноту разрушения лабильного фос5 фора. Таким образом, при анализе кислоторастворимой фракции в каждом случае определяли ортофосфат, 7 и 305минутный фосфор и общий фосфор. Близкое совпадение в наших опытах величин Р7м и

Р23м указывает, что уже в первые 7 мин. гидролиза появляется весь

лабильный фосфор. Это позволяет вычислить количество полифос5

фатов в кислоторастворимой фракции по разности: Рпф = Р7м–Рорт. Полученные данные по определению полифосфатов в кислотора5

створимой фракции представлены в табл. 1.

Кислотонерастворимый остаток после удаления кислотораство5 римой фракции трижды промывали 96% этанолом для удаления ос5 тавшейся хлорной кислоты. Обычно суммарное количество полифосфатов кислотонерастворимой фракции определяют по со5 держанию лабильного фосфора, гидролизующегося до ортофосфа5 та в течение 15 мин. при 90°С в 6% хлорной кислоте (экстракция по Шнейдеру). Чайен и др. (11) предложили проводить экстракцию в течение 1 часа. В этих условиях, по их данным, гидролизуется 94% полифосфатов и 15% фосфора нуклеиновой кислоты. Однако, в случае применения данной модификации существует опасность «заг5 рязнения» экстракта фосфором не только от частичной минерализа5 ции нуклеиновой кислоты, но и от не учитываемой минерализации других стабильных соединений фосфора (например, фосфорилиро5

ванные полисахариды, фосфопротеиды). Такое «загрязнение чужим фосфором» неизбежно, оно будет варьировать от объекта к объек5 ту, и уменьшить «загрязнение» можно лишь путем сокращения вре5 мени гидролиза. Поэтому в нашей работе общее содержание полифосфатов кислотонераствормого остатка определяли по лабиль5 ному фосфору, гидролизующемуся от ортофосфата в течение 7 мин. в 1 N HCI при 100°С. Согласно данным Эбеля (2), за первые 7 мин. гидролиза в 1 N HCL от нуклеиновых кислот отщепляется прибли5 зительно столько же фосфора, сколько расщепляется за последую5 щие 23 мин. Следовательно, количество полифосфатов кислото5 нерастворимой фракции можно вычислить по разности: Рпф= Р7м–

Р23м. Полученные результаты по определению полифосфатов кисло5

тонерастворимой фракции представлены в табл. 1.

Таблица 1

СОДЕРЖАНИЕ РАЗЛИЧНЫХ ФОРМ ФОСФОРА В ФОТОСИНТЕЗИРУЮЩИХ БАКТЕРИЯХ

(в процентах на сухой вес обезжиренной бактериальной массы)

Фотосин5 тезирующие бактерии

Р

общий

Р кислоторастворимый

Р кислотонерастворимый

орто5 фос5 фат

ла5 биль5 ный

ста5 биль5 ный

об5 щий

ла5 биль5 ный

нук5 леи5 новый

стабиль5 ный Р остатка

об5 щий

Chlorobium

thiosulpha5 tophilum

1,40

0,24

0,46

0,20

0,90

0,11

0,41

0,003

0,523

Rhodopseu5

domonas palustris

1,19

0,013

0,164

0,020

0,197

0,56

0,45

00,001

1,011

Chromatium

8,75

1,99

4,29

0,04

6,32

2,00

0,47

0,01

2,48

Представленные в табл. 1 данные по количеству лабильного фос5 фора свидетельствуют о наличии полифосфатов во всех трех изу5 ченных бактериях. Особенно высокое количество полифосфатов (более 70% от общего Р) обнаружено в клетках пурпурных серобак5 терий Chromatium.

В условиях экстракции кислотой полифосфаты присутствуют как

в свободной (кислоторастворимая фракция), так и в связанной (кис5 лотонерастворимая фракция) формах. Клетки исследуемых бакте5 рий не содержат сколько5нибудь значительных количеств ненуклеинового стабильного фосфора, и почти весь их фосфор при5 надлежит полифосфатам и нуклеиновым кислотам.

Окрашивание толуидиновым синим согласно технике, предло5 женной Эбелем (12), показало, что кислоторастворимая фракция всех

3 культур обнаруживает четкую метахромазию. Однако, после осаж5 дения полифосфатов кислоторастворимой фракции барием в кис5 лых условиях надосадочной жидкости исследуемых бактерий эта фракция сохраняет метахромазию, что прямо указывает на ее «непо5 лифосфатную» природу. Поскольку за «неполифосфатную» метахро5 мазию могут быть ответственны макромолекулярные полисахариды, содержащие сульфоэфирные радикалы (типа мукоитинсерной кисло5 ты), то можно предполагать наличие подобного типа веществ в иссле5 дованных препаратах бактерий.

Вместе с тем растворы кислоторастворимых полифосфатов, полу5 ченных после обработки бариевых осадков катионитом, не обнаружи5 вают метахромазии (в некоторых опытах с Rhodopseudomonas palustris иногда удается получить незначительное метахроматическое окраши5 вание). Так как давно Эбелем (12) было показано, что метахроматичес5 кое окрашивание дают лишь сравнительно длинные цепи конденсиро5 ванных фосфатов (начиная с 8 фосфорных групп), то можно пола5 гать, что кислоторастворимые фракции исследуемых бактерий содер5 жат только низкие полимеры фосфатов (менее 8 групп). Отмеченное незначительное метахроматическое окрашивание в препаратах Rhodopseudomonas palustris, очевидно, может указывать на присут5 ствие в кислоторастворимой фракции данной бактерии некоторого ко5 личества полифосфатов более высокой степени конденсации.

В настоящей работе культура зеленых серобактерий была изучена более детально. Данные по возрастным изменениям содержания по5 лифосфатов в кислоторастворимой и кислотонерастворимой фракци5 ях культуры Chlorobium thiosulphatophilum представлены в табл. 2.

Таблица 2

ВОЗРАСТНОЕ ИЗМЕНЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ КИСЛОТОРАСТВОРИМОГО И КИСЛОТОНЕРАСТВОРМОГО ЛАБИЛЬНОГО ФОСФОРА В КУЛЬТУРЕ ЗЕЛЕНЫХ СЕРОБАКТЕРИЙ CHLOROBIUM THIOSULPHATOPHILUM

(в процентах на сухой вес обезжиренной бактериальной массы)

lag5фаза5

12 час.

Начало lg5фазы5

24 час.

lg5фаза=

48 час.

Начало

стационар5 ной фазы

96час.

Стацио5

нарная фаза

192 часа

Лабильный Р кислото5 растворимой фракции

0,21

0,09

0,12

0,20

0,32

Лабильный Р кислото5

растворимой фракции

0,08

0,12

0,06

0,053

0,04

Общий Р навески

1,05

1,00

0,92

0,97

1,12

Общий Р полифос5 фатов

0,29

0,21

0,18

0,253

0,36

Полученные результаты свидетельствуют о том, что максимум на5 копления лабильного фосфора наблюдается в стационарной фазе рос5 та, когда процессы клеточного синтеза замедляются. В фазе логарифми5 ческого роста интенсивные процессы синтеза препятствуют сколько5 нибудь значительному накоплению полифосфатов. Особенно интерес5 но, что соотношение кислоторастворимых полифосфатов к кислотоне5 растворимым в lag5фазе и фазе логарифмического роста значительно смещены в сторону последних, т. е. более активных. Очевидно, такая закономерность является в известном смысле общей, так как она была показана уже на дрожжах (2), плесневых грибах (1) и бактериях (13).

Таким образом, полученные в настоящей работе аналитические

данные показывают на присутствие полифосфатов в клетках изучен5 ных представителей 3 различных семейств фотосинтезирующих бак5 терий. Есть основания полагать, что полифосфаты кислоторастворимой фракции, в основном, являются низкополимерными. Изучение воз5 растных изменений в содержании полифосфатов различных фрак5 ций (культура Chlorobium thioaulphatophilum) подтверждает закономерности, обнаруженные ранее в других организмах.

Приношу самую глубокую благодарность профессору А. Н. Бе5 лозерскому и А. С. Спирину за большую помощь в выполнении на5 стоящей работы, а также И. С. Кулаеву — за искренний интерес, проявленный к работе, и постоянные консультации по ряду практи5 ческих вопросов, связанных с ее выполнением.

Список литературы

Белозерский А. Н., Кулаев И. С. Биохимия, 22, 30, 1957.

Ebel E. P. Bull. Soc. Chim. biol., 34, 321, 330, 491, 498, 1952.

Krishnan P. S., Damle S. P., Bajaj V. Arch. Biochem. and Biophys., 67,

№ 1, 1957.

Niklowitz W., Drews G. Arc. Mikrobiol., 23, 123, 1955/

Vatter A. E., Wolfe R. S. J. Bacteriol., 75, 480, 1958.

Vatter A. E., Wolfe. S. The Report of the VII Intern. Congr. Microbiol., Stockholm, 1958.

Van Niel C. B. Arch. Microbiol., 3, H. 1, 1931. Larsen H. D. K. N. V. S. Skrifter, № 1, 1, 1953. Weil! Malherbe H., Green R. H. Biochem. J., 49, 286, 1951. Спирин А. С. Биохимия, 23, 656, 1958.

Chayen R., Chayen S.,Roberts E. R. Biochim. et biophys. acta, 16, 117,

1955.

Ebel E. R., Muller S. Exp. Cell. Res., 15, 21, 1958.

Mudd S., Yoshida A., Koike M. J. Bacteriol., 75, 224, 1958.

ДАН, 126, №2, 1959.

Изменения в природных биологических системах — В. Д. Федоров