ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ЦИТОКИНОВ ПРИ АТОПИЧЕСКОМ ДЕРМАТИТЕ В ЭКССУДАТЕ, ПОЛУЧЕННОМ МЕТОДОМ «КОЖНОГО ОКНА»

Е. А. Ермаков

Научный руководитель: др мед. наук, проф. В. В. Климов

Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск

Введение. Атопический дерматит (АтД) является одной из наибо лее распространенных форм аллергического поражения кожи. Показа тель распространенности АтД растет во всем мире. Распространенность АтД в детской популяции составляет до 1530%, во взрослой – до 210% [1]. Иммунопатогенез АтД – многоэтапный и сложный процесс, полно стью не изученный до настоящего времени и требующий дальнейшего более подробного исследования.

АтД – хроническое воспалительное заболевание кожи, развиваю щееся по IgEзависимому механизму, патогенез которого связан с дис

балансом иммунорегуляторных субпопуляций в сторону поляризации

Тх2 и соответствующим изменением их цитокинового профиля.

Исследование цитокинового профиля при АтД позволяет оценить характер воспаления, а также назначить соответствующую противовос палительную терапию.

Цель работы. Определить концентрацию IL4, IL10, IL17 и IFNγ в бесклеточной фракции экссудата «кожного окна» при атопическом дерматите в разные стадии болезни и в разных участках кожи.

Материал и методы. Концентрация цитокинов определялась в бес клеточных кожных экссудатах, получаемых согласно патенту №

1534395 на изобретение «Способ диагностики аллергического диатеза» В. В. Климова, Т. В. Кошовкиной, В. К. Раткина и А. А. Денисова (1993) и медицинской технологии «Способ оценки минимальной воспа лительной активности кожи при атопическом дерматите в стадии ремис сии» ФС №2010/217 (2010) [2, 3]. Обследовано 59 больных АтД и 10 здоровых добровольцев. Диагноз АтД устанавливался на основа нии данных анамнеза, клинической картины, кожного аллергологическо го тестирования, содержания IgE. Степень тяжести заболевания уста навливалась с учетом индекса SCORAD.

Переднюю сторону предплечья дезинфицировали спиртом. Затем в средней трети ладонной поверхности предплечья с помощью стерильного скальпеля удаляли верхний слой эпидермиса, не затрагивая более глубокие слои кожи. Удалив роговой слой на участке кожи площадью

0,5×0,5 см образовывалась поверхность с характерным блеском. Слой шиповатых клеток, базальных клеток и базальная мембрана эпидер миса оставались интактными. На скарифицированный участок помещали камеру объемом 1,0 мл, предварительно заполненную с помощью шприца стерильной средой 199. Камеру фиксировали на коже с помо щью лейкопластыря. Круговая обвязка предплечья лейкопластырем обеспечивала наиболее надежную фиксацию камеры.

Через 6 часов камера снималась, ее содержимое пипеткой собиралось и переносилось в пробирку. После центрифугирования экссудата получался супернатант, который в дальнейшем использовался для определения цитокинов.

С этой целью использовался твердофазный ИФА с применением пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента. Основным реа гентом набора являются моноклональные антитела к определяемому цитокину, иммобилизованные на поверхности лунок полистирольного планшета. Другой тип моноклональных антител к независимому эпитопу

молекулы цитокина находится в наборе в виде конъюгата с биотином. Индикаторным компонентом является конъюгат стрептавидина с перок сидазой хрена. После нескольких стадий инкубации и отмывок, количество связавшегося конъюгата с пероксидазой хрена, определяют цвет

ной реакцией с использованием субстрата для пероксидазы хрена – пе рекиси водорода. Интенсивность окрашивания прямо пропорциональна концентрации определяемого цитокина. Активность связанной перокси дазы измеряют с использованием автоматического фотометра для мик ропланшетов.

Для определения продукции IL4, IL10, IL17 и IFNγ были использо ваны наборы реагентов «ИЛ4ИФАБЕСТ», «ИЛ10ИФАБЕСТ», «ИЛ17ИФАБЕСТ» и «гаммаИНТЕРФЕРОНИФАБЕСТ» (ЗАО «Вектор Бест», г. Новосибирск). Постановку ИФА проводили в соответствии с ме тодическими рекомендациями производителя.

Анализ результатов ИФА проводили на микропланшетном ридере

Multiscan EX («Labsystems», Финляндия). Расчет концентрации цитоки нов осуществлялся по калибровочной кривой с помощью компьютерной программы. Количество выражали в пикограммах на миллилитр (пг/мл). Статистическая обработка результатов исследования проводилась с помощью пакета статистических программ «SPSS». Для представления количественных данных, не подчиняющихся нормальному закону рас пределения, использовались описательные статистики: Ме (медиа на), Q1 (1й квартиль (25%)) и Q3 (3й квартиль (75%)). Для всех имею щихся выборок данных применялись непараметрические критерии Крас калУолиса и Манна – Уитни.

Также была исследована зависимость концентраций цитокинов от конкретных участков кожи (условно здорового или лихенифицированно го), на которые устанавливась камеры. Сделан анализ, где учитывались данные по содержанию цитокинов кожного экссудата в разных местах установки камеры.

Результаты и обсуждение. В периоде ремиссии сохраняется, в ос новном, та же направленность в отклонениях в содержании цитокинов, что была отмечена в периоде обострения. Наблюдаются высокие уровни IL4 и IL10, при этом снижение IFN в стадию ремиссии более значи тельное и достоверно отличается по отношению к обобщѐнной группе

больных АтД в остром периоде. Эти данные согласовываются с литера турным источником [1].

Далее для исследования зависимости концентраций цитокинов от

конкретных участков кожи (условно здорового или лихенифицированно го), на которые устанавливась камеры, сделан анализ, где учитывались данные по содержанию цитокинов кожного экссудата в разных местах установки камеры.

В результате исследования было установлено, что место установки камеры влияет только на IL10, содержание которого существенно воз растает в очагах лихенификации по сравнению со здоровыми участками

кожи. Это согласовывается с особенной ролью IL10 в аллергических процессах. IL10 вырабатыввается несколькими видами клеток (Тх2, Tr1,

дендритные клетки и др.). Повидимому, многие их них вовлечены в процессы ремоделлирования кожи.

Выводы:

1. В периодах обострения и ремиссии АтД отмечается повышение IL4 и снижение IFN. При этом снижение IFN в стадию ремиссии более значительное и достоверно отличается по отношению к обобщѐнной группе больных АтД в остром периоде.

2. Место установки камеры влияет только на IL10, содержание кото рого существенно возрастает в очагах лихенификации по сравнению со

здоровыми участками кожи.

Список литературы:

1. Atopic Dermatitis / Bernice R Krafchik // eMedicine, Jan 19, 2010 [Электронный ре сурс] – Режим доступа: http://emedicine. medscape. com/article/1049085overview

2. Медицинская технология «Способ оценки минимальной воспалительной актив ности кожи при атопическом дерматите в стадии ремиссии" ФС№2010/217 от

10.06.2010// Климов В. В., Денисов А. А., Фирсова Е. К, Саликова Т. И., Загрешен ко Д. С.

3. Пат. 1534395 РФ. Способ диагностики аллергического диатеза / Климов В. В., Кошовкина Т. В., Раткин В. К. и др.; опубл. 10.09.1993.

4. Ключевые цитокины профиля Th1 и Th2 в кожном экссудате при атопическом дерматите / Д. С. Загрешенко // "Науки о человеке" // Сибирский государствен ный медицинский университет – Томск, 2007. – 273 с.

Материал взят из: Медикобиологические науки: достижения и перспективы (г. Томск, 10-11 ноября 2011 г.): сборник материалов I Всероссийской научной студенческой конференции