ОЦЕНКА ПАРАМЕТРОВ ОПУХОЛЕВОГО РОСТА WALKER 256 ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ЦИТОСТАТИКАМИ (ЦИКЛОФОСФАНОМ И МЕЛАТОНИНОМ)

А. С. Виноградов, А. А. Кибанова

Научные руководители: др мед. наук, членкорр. РАМН, проф. А. В. Ефремов, канд. мед. наук, доц. Е. В.Овсянко Новосибирский государственный университет, г. Новосибирск

Введение. Проблема регуляции клеточной пролиферации в нор мальных и трансформированных клетках является одной из фундамен тальных проблем медицины. В современных клинических и эксперимен тальных исследованиях при оценке эффективности и разработке проти воопухолевой терапии основное внимание уделяется влиянию химиче ских агентов на стимуляцию гибели опухолевых клеток, подавление их пролиферации, метастатической активности и неоангиогенеза.

Разные химические воздействия вызывают разную интенсивность изменений биологических свойств опухолей. Поэтому для выбора

наиболее эффективного режима противоопухолевой терапии часто используют комбинированные воздействия, проводится поиск новых вари антов сочетания известных и неизвестных агентов с антибластомной ак тивностью.

Цель работы изучить патоморфогенез и основные параметры опухолевого роста карциносаркомы Walker 256 при ее трансплантации в мышцу бедра крыс Вистар и при проведении противоопухолевой тера пии с использованием циклофосфана, мелатонина и их сочетаний.

Материал и методы. В эксперименте использовали крыс самцов по роды линии Wistar, массой 180200 г. Работу с животными проводили с со блюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) и Хельсинской декларации. Использовали перевиваемый штамм опухоли Walker256 (W256), поддерживаемый in vivo

(Лаборатория физиологической генетики Института цитологии и генети ки СО РАН, Новосибирск). Суспензию клеток перевиваемой карциносар комы W256 вводили животным мышцу бедра в дозе 1 × 106 клеток в 0,1 мл изотонического раствора NaCl [3]. Через 5 суток, с момента перевив ки карциносаркомы Walker256, измеряли ее размеры штангенциркулем в трех взаимно перпендикулярных направлениях и определяли объем опухоли.

Животных разделили на 4 группы (по 7 в группе): 1я группа – кон трольная группа – со «спонтанным» развитием карциносаркомы Walker256, 2я группа – животные с карциносаркомой Walker256 при воздействии циклофосфаном (ЦФ) («Биохимик», Саранск, Россия); 3я группа – животные с карциносаркомой Walker256 при воздействии ме латонином (МТ) (ICN Biomedicals Inc. USA). ЦФ вводили однократно из

расчета 25 мг/кг внутрибрюшинно. МТ в дозе 0,3 мг/кг вводили внутри брюшинно в течение 14 сут. Все манипуляции совершались, спустя 5 сут, с момента перевивки опухоли. Животных содержали при фиксиро ванном световом режиме (свет – темнота 12:12). На светооптическом уровне исследовали образцы W256 на 3, 7 и 14 сутки, после воздействия цитостатиками. Для получения образцов опухоли крыс декапитировали под эфирным наркозом. Макроскопический анализ проводили с вычис лением объема опухоли, размеры измеряли штангенциркулем в трех взаимно перпендикулярных направлениях.

Полученные данные обрабатывали с использованием общеприня тых методов статистики [2] на основании tкритерия Стьюдента для

уровня достоверности 95% (p < 0,05).

Результаты и обсуждение. Согласно полученным данным, гисто генетически W256 относится к опухолям молочной железы и является

смешанной опухолью, образованной как саркоматозными (условно

стромальными), так и эпителиоидными (условно паренхиматозными) компонентами; характеризуется инфильтративным ростом. Опухолевые клетки образовывали солидные комплексы, пласты и тяжи, которые внедрялись вдоль мышечных волокон и кровеносных сосудов, нарушая архитектонику и кровоснабжение скелетной мышцы.

В химиотерапии злокачественных опухолей применяются лекар ственные средства, прежде всего направленные на необратимое повреждение клетки. Действия противоопухолевых цитостатических препара тов, реализуется путем индукции апоптоза [1]. Известно, что противо опухолевое действие ЦФ реализуется непосредственно в клетках опухо лей, где приводит к нарушению жизнедеятельности этих клеток и блокированию их митотического деления. При воздействии ЦФ в опухолевом узле практически отсутствовали «светлые» клетки, основную массу со ставляли мелкие округлые или вытянутые клетки с гиперхромными яд рами. Сохранившиеся светлые клетки часто были многоядерными, обособлялись, цитоплазма их образовывала выросты; такие морфологические превращения клеток отражали их миграционную способность, т. е. способность к метастазированию. Опухоль содержала значительное

количество тонкостенных сосудов капиллярного типа.

Через 14 сут происходила реверсия фенотипа опухоли, в ней опять преобладали «светлые» клетки. Отмечали варьирующие по размерам очаги некроза.

В настоящее время рассматриваются возможности иммунотерапии в онкологической практике, которая способствует восстановлению иммунокомпетентости, повышению специфического противоопухолевого иммунитета, предупреждению иммунодепрессии. Учитывая присущие МТ его цитостатические, антиоксидантные свойства [5], его роль в механизмах апоптоза, представляет интерес для изучение МТ в качестве

возможного модификатора канцерогенеза.

После воздействия МТ отмечалось усиление структурированности опухолевого узла, усиливающееся к 14 сут эксперимента: по периферии узла светлые клетки образовывали псевдофолликулярные структуры, в центре – преобладали более мономорфные клетки, среди которых рас полагались темные клетки, иногда образовывавшие тяжи. Опухоль была хорошо васкуляризирована; сосуды были полнокровными. В опухолевом узле регистрировались многочисленные мелкие очаги некроза.

При воздействии ЦФ с МТ отмечались выраженные некротические изменения опухолевых клеток: в одних зонах – диффузные, в других – очаговые; по периферии отмечался распад ткани. К 7м суткам происходило значительное изменение строения и архитектоники опухолевого узла: в нем практически исчезали «светлые» клетки, значительная часть

опухоли была представлена вытянутыми саркоматозными клетками, инфильтрирована лимфоцитами. Через 14 сут происходила реверсия фенотипа опухоли: опухолевый узел вновь был образован преимуще ственно «светлыми» клетками, которые образовывали псевдофоллику лярные структуры, располагавшиеся по периферии, в центре опухоли – скопления мономорфных эозинофильных клеток с небольшими очагами некроза.

Анализ основных параметров опухолевого роста W256 показал, что прогрессивный рост карциносаркомы без лечения характеризовался

достаточно высоким митотическим индексом (34,8±1,4‰) и низким апоптотическим индексом (0,7±0,2‰). Снижение митотического индекса опухолевых клеток выявлено на всех сроках наблюдения после приме нения ЦФ и МТ. Апоптотический индекс увеличивался при всех видах

использованных воздействий, но наиболее значительно он повышался в разные сроки при включении МТ. Через 7 и 14 сут – в группе ЦМ (в 11 и

5,7 раза соответственно).

Карциносаркома Walker 256 относится к модельным опухолям, обу словливающим развитие синдрома анорексии/кахексии, который, в свою

очередь, ассоциирован с высокой смертностью в результате катаболиз ма белков скелетных мышц [4]. Уменьшение объема W256 было только

при проведении терапии с включением ЦФ. При этом максимальное зна чение данный показатель отмечали при сочетанном воздействии ЦФ и МТ. При сочетании МТ с ЦФ величина показателя ТРО достигала мак симальных значения.

Одним из системных проявлений неопластического потенциала яв ляется опухолевая кахексия. При «спонтанном» развитиии W256 масса

тела крыс (без учета опухолевого узла) снижалась к 19м суткам на 19%. При этом, мышечные волокна не только подвергались значительным ли тическим повреждениям в опухолевом узле, но и активной инвазии опухолевых клеток в мышечные волокна с резорбцией саркоплазмы.

В группах, получавших ЦФ как моноагент, так и в сочетании с МТ, отмечали, что масса тела крыс снижалась по сравнению с контрольной группой всего лишь на 6 – 8%, что свидетельствовало об отсутствии по тери мышечной массы.

Злокачественный рост характеризуется метастазирующим ростом клеток. При «спонтанном» развитии W256 к концу эксперимента возрос ла частота метастазов в подвздошные и паховые лимфатические узлы.

После воздействия МТ частота метастазов в лимфатических узлах выявлялись реже в 1,7 и 3,4 раза, чем при «спонтанном» развитии опу холи. При воздействии ЦФ метастазы выявлялись только на 14 сут. Со четанное использование ЦФ с МТ приводило к полному отсутствию метастазирования на протяжении всего эксперимента.

Выводы. Анализ основных параметров опухолевого роста карцино саркомы Walker 256 (митотического индекса, интенсивности некроза и

апоптоза, степени дифференцировки, метастатического потенциала) и

системных проявлений неопластического процесса (неопластической кахексии) после изолированного и сочетанного применения циклофос фана и мелатонина свидетельствует о том, что наибольшая эффектив ность терапии достигается при сочетанном применении химических агентов с разными механизмами действия.

Список литературы:

1. Апоптоз и его роль в развитии опухолевого роста / Владимирская Е. Б., Масчан

А. А., Румянцев А. Г // Гематол. трансфузиол. – 1997. – № 42. – С. 49.

2. Медикобиологическая статистика / Гланц С. – М.: Практика, 1998. – 459 с.

3. Динамика опухолевого роста у крыс линии Brattleboro и Wag при введении раз ных доз карциносаркомы Walker 256 / Хегай И. И., Попова Н. А., Ганилова Л. С. и др.// Бюл. экспер. биологии и медицины. – 2008. – Т. 145. – №1. – С. 88–90.

4. Production of cachexia mediators by Walker 256 cells from ascitic tumors / Rebeca

R., Bracht L. et al. // Cell. Biochem. Funct. – 2008. – Vol. 26. – № 6. – P. 731 – 738.

5. Melatonin rhithmicity: effect of age and Alzheimer’s disease / Skene D. J., Swaab D. F.

// Exp. Gerontol. – 2003. – Vol. 38. – № 1 – 2. – P. 199 – 206.

Материал взят из: Медикобиологические науки: достижения и перспективы (г. Томск, 10-11 ноября 2011 г.): сборник материалов I Всероссийской научной студенческой конференции