ОЦЕНКА ОПЛОДОТВОРЯЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ СПЕРМАТОЗОИДОВ У ОЗЕРНОЙ ЛЯГУШКИ, PELOPHYLAX RIDIBUNDUS (PALLAS, 1771) В УСЛОВИЯХ АНТРОПОГЕННО-ИЗМЕНЕННЫХ ЛАНДШАФТОВ

Е. А. Байтимирова

Институт экологии растений и животныхУрО РАН, Екатеринбург, Россия

bay@ipae. uran. ru

THE ASSESSMENT OF IMPREGNATING SPERMATOZOID CAPACITY IN MARSH FROG, PELOPHYLAX RIDIBUNDUS (PALLAS, 1771)

IN ANTHROPOGENICALLY MODIFIED LANDSCAPES

E. A. Baytimirova

Institute of Plant and Animal Ecology of the RAS, Ekateriburg, Russia

В последнее время в литературе большое внимание уделяется влиянию на амфибий веществ, вызывающих эндокринный дисбаланс, что, в свою очередь, может привести к отклонениям в половом развитии и появлению интерсексуальных особей, характеризу — ющихся одновременным присутствием женских и мужских признаков (Никитин, 2008).

Химические вещества, для которых характерны гормоноподобные свойства, поз — воляющие им взаимодействовать с рецепторами к половым стероидам и модулировать их действия на ткани – мишени, получили название «эндокринные деструкторы» (En — docrine disruptors) (Никитин, 2008). Способность связываться со специфическими ре — цепторами половых стероидов у этих соединений обусловлена тем, что подобно стеро — идным гормонам, многие из них по своей структуре являются фенолами или содержат

«эквивалент фенола». Многие из них характеризуются высокой устойчивостью к хими — ческой, физической и фотодеградации, поэтому они десятилетиями сохраняются в окружающей среде.

У низших позвоночных, как и у млекопитающих, основным регулятором генера — тивной функции является эстрадиол и подобные ему соединения. Один из распростра — ненных на сегодняшний день гербицидов – атразин, как и другие гормональные де — структоры, содержит «эквивалент фенола» и тем самым может модулировать в орга — низме животных действие эстрадиола. Свидетельством подобного действия атразина стали многочисленные публикации о ненормальном сексуальном развитии при воздей — ствии сельскохозяйственных гербицидов. При этом в литературе преобладают данные о присутствии ооцитов в ткани семенника (Reeder et al., 1998; Hayes et al., 2003; Hecker et al., 2004; Smith et al., 2005; Murphy et al., 2006; McDaniel et al., 2008; Du Preez et al.,

2009). В целом в список веществ с возможными гормоноподобными свойствами входет более двух тысяч наименований различных органических соединений. Из недавних ра — бот, посвященных этой проблеме, особый интерес представляют исследования ученых из Йельского университета (США) на зеленых лягушках (Rana clamitans Latreille, 1801), которые уделили особое внимание тщательному выбору, картированию и типизации водно-болотных угодий для сбора амфибий. Авторами было проведено изучение гисто — логической структуры семенников амфибий на предмет обнаружения в их ткани ооци — тов. В работе показано, что частота встречаемости ооцитов в семенниках амфибий в пригородных и городских районах значительно выше по сравнению с сельскохозяй — ственными районами и районами без промышленной и сельскохозяйственной нагрузки (Skelly et al., 2010).

Одним из основных показателей оплодотворяющей способности сперматозоидов является размер головки. Вариабельность сперматозоидов по величине головки связана с различным содержанием в них ДНК, определяющим степень зрелости сперматозои — дов (конденсация, упаковка хроматина) (Мамина и Жигальский, 2006). В настоящее

время активно изучается влияние структурной организации хроматина в сперматозои — дах и процесса его упаковки на способность сперматозоида к оплодотворению (Дедов и др., 2010; Арифулин, 2012; Багиров и др., 2012). В частности показано, что реорганизация мужского генома, активация и экспрессия отцовских генов после оплодотворения и на ран — них стадиях эмбриогенеза зависят от их структурной организации и пространственной упа- ковки в сперматозоиде (Мудрак, 2006). Следовательно, дегенеративные процессы в семен — ных канальцах, обусловленные действием повреждающих факторов, в том числе и эндо — кринных деструкторов, могут привести к формированию патологических и атипичных полиморфных сперматозоидов, которые не способны участвовать в оплодотворении.

Причиной проведения данного анализа послужила поимка в 2012 г. на территории ЦПКиО (Центральный парк культуры и отдыха) г. Екатеринбург особи озерной лягуш — ки (Pelophylax ridibundus), которая внешне выглядела как самец (наблюдались брачные мозоли), а при вскрытии обнаружились признаки гермафродитизма: в организме жи — вотного одновременно присутствовали и семенник, и яичник.

Поскольку ранее особей с признаками гермафродитизма в отловах не встречали, была проведена оценка оплодотворяющей способности сперматозоидов и гистологиче — ское изучение семенников с целью обнаружения ооцитов у P. ridibundus в условиях ан — тропогенно-измененных ландшафтов указанной территории.

На мазковых (окраска азур-эозином по Романовскому) и гистологических (окрас — ка гематоксилин-эозином) препаратах семенника P. ridibundus было проведено измере — ние и сравнительный анализ площадей головок сперматозоидов. На серийных срезах семенников животных проведено микроскопическое (увеличение 10х10; 40х10) иссле — дование относительно присутствия ооцитов в ткани семенников. При анализе изменчи — вости площади головки сперматозоидов у P. ridibundus был использован однофактор — ный дисперсионный анализ.

В работе исследовали половозрелых самцов (всего 27 животных), отловленных в

двух местообитаниях на территории г. Екатеринбург с разным уровнем антропогенной нагрузки (ЦПКиО и лесопарк Калиновские разрезы) и на территории г. Нижний Тагил (р. Малая Кушва). Согласно ландшафтной типизации В. Л. Вершинина (Вершинин и др., 2006), а также проведенным ранее исследованиям по гидрохимии изучаемых водо — емов в г. Екатеринбург, район ЦПКиО был отнесен к зоне малоэтажной застройки; ле — сопарк Калиновские разрезы к лесопарковой зоне. В градиенте урбанизации отмечено увеличение общей минерализации, содержания хлорид и сульфат ионов, повышение эвтрофикации водоемов, изменение pН среды с кислой на нейтральную (Вершинин и др., 2006). Вода в р. Малая Кушва, которая протекает по территории г. Нижний Тагил, относится к чрезвычайно грязным. Река предоставлена Министерством природных ре — сурсов Свердловской области в пользование Нижнетагильскому металлургическому комбинату (превышение ПДК по нефтепродуктам в 12 раз, по фенолам – до 5 раз, по марганцу – в 3 раза) (Петрова, 2011). Поступающие в реку нагретые сточные воды формируют тепловое загрязнение реки.

При морфометрическом исследовании сперматозоидов P. ridibundus на мазковых препаратах установлено, что размер головки сперматозоида варьирует от 20,1 до 68,1 мкм2. Головки сперматозоидов у животных, населяющих лесопарк, статистически значимо больше в сравнении с другими изучаемыми районами. Наименьшая площадь головок отмечена в районе поимки гермафродитной особи – ЦПКиО (Рис. 1).

При изучении гистологической структуры семенников животных ооциты были обнаружены только в ткани семенника гермафродита. При этом ооциты обнаружива — лись только в верхней части семенника. Наряду с присутствием ооцитов, в этой части органа отсутствовали семенные канальцы, содержащие сперматозоиды.

Рис. 1. Площадь головки сперматозоида озерной лягушки

(средние ± 0.95 доверительный интервал), F (2, 514) = 4.25, (p =0.01)

На срединных срезах органа присутствия ооцитов в ткани семенника не наблюда — лось. Семенные канальцы содержали все типы клеток, включая сперматозоиды. В тка — ни других половозрелых самцов, отловленных на территории ЦПКиО, ооцитов обна — ружено не было.

Нами была предпринята попытка оценки площадей головок сперматозоидов у гермафродита. Поскольку мазковый препарат семенника гермафродита отсутствовал ввиду использования органа для изготовления гистологических срезов, измерения го — ловок сперматозоидов были проведены на срединных срезах органа. Для сравнительно — го анализа было проведено измерение площадей головок сперматозоидов на гистологи — ческих срезах семенников и у нормальных самцов. Данные представлены в таблице 1.

Таблица 1

Площадь головки сперматозоида озерной лягушки

>В работе исследовали половозрелых самцов (всего 27 животных), отловленных в

двух местообитаниях на территории г. Екатеринбург с разным уровнем антропогенной нагрузки (ЦПКиО и лесопарк Калиновские разрезы) и на территории г. Нижний Тагил (р. Малая Кушва). Согласно ландшафтной типизации В. Л. Вершинина (Вершинин и др., 2006), а также проведенным ранее исследованиям по гидрохимии изучаемых водо — емов в г. Екатеринбург, район ЦПКиО был отнесен к зоне малоэтажной застройки; ле — сопарк Калиновские разрезы к лесопарковой зоне. В градиенте урбанизации отмечено увеличение общей минерализации, содержания хлорид и сульфат ионов, повышение эвтрофикации водоемов, изменение pН среды с кислой на нейтральную (Вершинин и др., 2006). Вода в р. Малая Кушва, которая протекает по территории г. Нижний Тагил, относится к чрезвычайно грязным. Река предоставлена Министерством природных ре — сурсов Свердловской области в пользование Нижнетагильскому металлургическому комбинату (превышение ПДК по нефтепродуктам в 12 раз, по фенолам – до 5 раз, по марганцу – в 3 раза) (Петрова, 2011). Поступающие в реку нагретые сточные воды формируют тепловое загрязнение реки.

При морфометрическом исследовании сперматозоидов P. ridibundus на мазковых препаратах установлено, что размер головки сперматозоида варьирует от 20,1 до 68,1 мкм2. Головки сперматозоидов у животных, населяющих лесопарк, статистически значимо больше в сравнении с другими изучаемыми районами. Наименьшая площадь головок отмечена в районе поимки гермафродитной особи – ЦПКиО (Рис. 1).

При изучении гистологической структуры семенников животных ооциты были обнаружены только в ткани семенника гермафродита. При этом ооциты обнаружива — лись только в верхней части семенника. Наряду с присутствием ооцитов, в этой части органа отсутствовали семенные канальцы, содержащие сперматозоиды.

Рис. 1. Площадь головки сперматозоида озерной лягушки

(средние ± 0.95 доверительный интервал), F (2, 514) = 4.25, (p =0.01)

На срединных срезах органа присутствия ооцитов в ткани семенника не наблюда — лось. Семенные канальцы содержали все типы клеток, включая сперматозоиды. В тка — ни других половозрелых самцов, отловленных на территории ЦПКиО, ооцитов обна — ружено не было.

Нами была предпринята попытка оценки площадей головок сперматозоидов у гермафродита. Поскольку мазковый препарат семенника гермафродита отсутствовал ввиду использования органа для изготовления гистологических срезов, измерения го — ловок сперматозоидов были проведены на срединных срезах органа. Для сравнительно — го анализа было проведено измерение площадей головок сперматозоидов на гистологи — ческих срезах семенников и у нормальных самцов. Данные представлены в таблице 1.

Таблица 1

Площадь головки сперматозоида озерной лягушки

th=203 valign=top style=’width:152.6pt;border-top:none;border-left: none;border-bottom:solid black 1.0pt;border-right:solid black 1.0pt; mso-border-top-alt:solid black.5pt;mso-border-left-alt:solid black.5pt; mso-border-alt:solid black.5pt;padding:0cm 0cm 0cm 0cm;height:23.5pt’>

20,5±0,34

15,19

42,3

Половозрелый самец

(мазок семенника)

16

38,3±0,44

28,76

68,09

При морфометрическом исследовании сперматозоидов на гистологических срезах органа установлено, что размер головки сперматозоида варьирует от 15,19 до 42,3 мкм2. При сравнении значений площадей головок сперматозоидов нормальных самцов, полу — ченных на мазковых препаратах с результатами измерений головок на гистологических срезах с помощью однофакторного дисперсионного анализа, показано, что площади головок, измеренных на мазковых препаратах, значимо больше (F(1, 247)=895,28,

p<0,01). Вероятно, это связано с особенностями изменения тканей органа в процессе гистологической проводки. Таким образом, результаты свидетельствуют о невозмож — ности сравнения данных, полученных на срезах органа, со значениями, полученными на мазковых препаратах семенника.

Вместе с тем сравнительный анализ площадей головок сперматозоидов у нор — мальных самцов и гермафродита показал значимые различия. Площади головок спер — матозоидов гермафродита меньше по сравнению с нормальными самцами (табл. 1; F(1, 151)=29,360, p<0,01).

Наличие атипичных полиморфных спермиев, как правило, является результатом хромосомных аббераций при клеточной дифференциации в семеннике. Дегенеративные изменения в герминативном отделе семенника вызывают элиминацию и дегенерацию хромосом, в результате чего образуются олигопиренные сперматозоиды, т. е. спермато — зоиды с недостаточным содержанием хроматина (с малым размером головки). Причи — ной появления подобных сперматозоидов может быть нарушения деления сперматоци — тов в семеннике, которое приводит к образованию многоядерных клеток (Мамина и Жигальский, 2006).

Одной из наиболее вероятных причин, ведущих к нарушениям в упаковке хрома — тина спермиев, считаются не генетические изменения, а нарушения сперматогенеза в результате каких-либо патологических процессов или неблагоприятных воздействий окружающей среды (Воробьева и др., 1998).

По-видимому, размер головок сперматозоидов у озерной лягушки можно отнести к достаточно чувствительным к неблагоприятному воздействию параметрам.

Одной из вероятных причин появления гермафродитной особи озерной лягушки на территории ЦПКиО является загрязнение нерестового водоема легкоокисляемыми органическими веществами, обладающими гормоноподобными свойствами, и это тре — бует проведения дополнительных исследований.

Список литературы

1. Арифулин Е. А. Структурная организация нуклеопротаминового хроматина в сперматозоидах человека: автореф. дис. … канд. биол. наук. М., 2012. 24 с.

2. Багиров В. А., Кононов В. П., Иолчиев Б. А., Кленовицкий П. М., Эрнст Л. К. Фер — тильность сперматозоидов и состояние хроматина: методы контроля // Сельскохозяй — ственная биология, 2012. № 2. С. 3–13.

3. Воробьева О. А., Леонтьева О. А., Семенова Е. В., Филатов М. В. Влияние ано — мальной организации хроматина сперматозоидов на развитие эмбрионов человека // Проблемы репродукции, 1998. № 1. С. 14–18.

4. Дедов И. И., Макарова Н. П., Витязева И. И., Боголюбов С. В. Морфологические структуры сперматозоида, влияющие на эффективность оплодотворения методом ИКСИ (клиническая лекция) // Проблемы репродукции, 2010. № 3. С. 64–67.

5. Вершинин В. Л., Середюк С. Д., Черноусова Н. Ф., Толкачев О. В., Силс Е. А. Пути адаптациогенеза наземной фауны к условиям техногенных ландшафтов. Екатеринбург: УрО РАН, Банк культурной информации, 2006. 182 с.

6. Мамина В. П., Жигальский О. А. Оценка оплодотворяющей способности спер — матозоидов у рыжей полевки (Clethrionomys glareolus) на разных фазах динамики чис — ленности // Успехи современной биологии, 2006. Т. 126. № 4. С 413–420.

7. Мудрак О. С. Архитектура хромосом в ядре сперматозоида человека: автореф.

дис. … канд. биол. наук. СПб, 2006. 24 с.

8. Никитин А. И. Вредные факторы среды и репродуктивная система человека

(ответственность перед будущими поколениями). СПб.: ЭЛБИ-СПб, 2008. 237с.

9. Петрова И. Хотим знать, чем дышим // Тагильский рабочий: ежедневная го — родская общественно-политическая газета 2011. Дата обновления: 12.07.2011. URL: http://tagilka. umiks. su (дата обращения: 10.11.2011).

10. Du Preez L. H., Kunene N., Hanner R., Giesy J. P., Solomon K. R., Hosmer A., Van der Kraak G. J. Population-specific incidence of testicular ovarian follicles in Xenopus laevis from South Africa: A potential issue in endocrine testing // Aquatic Toxicology, 2009. № 95. P. 10–16.

11. Hayes T., Haston K., Tsui M., Hoang A., Haeffele C., Vonk A. Atrazine-induced hermaphroditism at 0.1 ppb in American leopard frogs (Rana pipiens): Laboratory and field evidence // Environmental Health Perspectives, 2003. V. 111. P. 568–575.

12. Hecker M., Giesy J. P., Jones P. D., Jooste A. M., Carr J. A., Solomon K. R., Smith E. E., Van Der Kraak G., Kendall R. J., du Preez L. Plasma sex steroid concentrations and gonadal aromatase activities in African clawed frogs (Xenopus laevis) from South Africa // Environmental Toxicology and Chemistry, 2004. № 23. P. 1996–2007.

13. McDaniel T. V., Martin P. A., Struger J., Sherry J., Marvin C. H., McMaster M. E., Clarence S., Tetreault G. Potential endocrine disruption of sexual development in free rang — ing male northern leopard frogs (Rana pipiens) and green frogs (Rana clamitans) from areas of intensive row crop agriculture // Aquatic Toxicology, 2008. № 88. P. 230–242.

14. Murphy M. B., Hecker M., Coady K. K., Tompsett A. R., Higley E. B., Jones P. D., Du Preez L. H., Solomon K. R., Carr J. A., Smith E. E., Kendall R. J., Van Der Kraak G., Giesy J. P. Plasma steroid hormone concentrations, aromatase activities and GSI in ranid frogs collected from agricultural and non-agricultural sites in Michigan (USA) // Aquatic Toxicology, 2006.

№ 77. P.153–166.

15. Reeder A. L., Foley G. L., Nichols D. K., Hansen L. G., Wikoff B., Faeh S., Eisold J., Wheeler M. B., Warner R., Murphy J. E., Beasley V. R. Forms and prevalence of intersexuality and effects of environmental contaminants on sexuality in cricket frogs (Acris crepitans) // Environmental Health Perspectives, 1998. № 106. P. 261–266.

16. Skelly D. K., Susan R. Bolden & Kirstin B. Dion. Intersex Frogs Concentrated in

Suburban and Urban Landscapes / EcoHealth, 2010. V. 7.I.3. P. 374–379.

17. Smith E. E., Du Preez L. H., Gentles A., Solomon K. R., Tandler B., Carr J. A., Van der Kraak G. L., Kendall R. J., Giesy J. P., Gross T. S. Assessment of laryngeal muscle and tes — ticular cell types in Xenopus laevis (Anura Pipidae) inhabiting maize and non-maize growing areas of South Africa // African Journal of Herpetology, 2005. № 54. P.69–76.

Материал взят из: Современная герпетология: проблемы и пути их решения — Первая международная молодежная конференция герпетологов России и сопредельных стран Санкт-Петербург, Россия 25–27 ноября 2013 г.