Молекулярное моделирование динамики взаимодействия ци бопиоидных рецепторов с соответствующими агонистами и антагонистами

Л.Р. Никогосян1, Г.Р. Асланян1, Г.С. Вартанян1,2, К.Б.Назарян1,3

1 Российско-Армянский (Славянский) университет 2Ереванский государственный медицинский университет имени М.Гераци 3Институт молекулярной биологии НАН РА

Аннотация. Целью данного исследования является создание новых бивалентных лигандов опиоидных рецепторов, наделенных определенными преимуществами в отношении эффективности и, по возможности, лишенных побочных эффектов. Для конструирования новых лигандов с улучшенными свойствами нами был использован метод молекулярного моделирования. При этом, прежде всего была предпринята попытка моделирования динамики взаимодействия допиоидного рецептора с классическим агонистом морфином, а также динамики взаимодействия 5-опиоидного рецептора с антагонистом налоксоном.

Ключевые слова: опиоидные рецепторы, анальгетики, лиганды, молекулярное моделирование

ВВЕДЕНИЕ

В 1973г. в головном и спинном мозге позвоночных животных были обнаружены участки связывания опиатов препаратов, полученных из застывшего млечного сока опия. Эти локальные образования получили название опиоидных рецепторов. Традиционно все опиоидные рецепторы делятся на 3 класса: д, 5, к [2, 3]. Фармакологические данные независимых исследовательских групп выявили наличие различных подтипов опиоидных рецепторов (51, 52, к1, к2, д1, д2, и т.д.) [1, 4], основываясь прежде всего на способности взаимодействовать с различными агонистами и антагонистами. Опиоидные рецепторы (ОР) широко распространены в ЦНС и во многих внутренних органах. Распределение ОР в

ЦНС очень вариабельно. Плотное размещение рецепторов обнаружено в задних рогах спинного мозга, в среднем мозге, в коре головного мозга и таламусе.

подпись: клонирование 5-, а затем ц - и к-рецепторов показало, что опиоидные рецепторы являются о-белок связанными рецепторами (орся). все они имеют

Активация опиоидных рецепторов происходит при взаимодействии с эндогенными опиоидными лигандами опиоидными пептидами. Для ц-рецептора специфическим лигандом являются эндорфины, для 5-рецептора энкефалины, для к-рецептора динорфины [8, 9, 13]. Опиоидные пептиды образуются в нервной системе, а также пищеварительном тракте, надпочечниках, половых железах, иммунокомпетентных клетках. Они могут воздействовать на клеткимишени по эндокринному, нейрокринному, паракринному и медиаторному типу. Эндогенные опиоидные пептиды взаимодействуют с опиоидными рецепторами всякий раз, когда в результате преодоления болевого порога, возникают болевые раздражения. Активация этих рецепторов специфически угнетает работу нейронов и ингибирует высвобождение нейромедиаторов и гормонов. Опиоиды ингибируют путь центральной нервной системы от спинного мозга до коры головного мозга, блокируют синтез гипоталамических и нейрогипофизарных гормонов, подавляют вегетативные эффекторные системы на периферии [5-7]. При активации опиоидных рецепторов происходит ингибирование аденилатциклазы, а также осуществляется регулирование ионных каналов. Закрытие потенциал-зависимых кальциевых каналов в пресинаптическом участке ведет к уменьшению выброса возбуждающих нейромедиаторов, а активация калиевых каналов в постсинаптическом нейроне приводит к гиперполяризации мембраны, что, в свою очередь, уменьшает чувствительность нейрона к возбуждающим нейромедиаторам (рис.1).

Рис.1. Механизм активации опиоидных рецепторов.

идентичную структуру: состоят из 7 гидрофобных трансмембранных доменов, 3 интрацеллюлярных и 3 экстрацеллюлярных петель. N-терминальный конец имеет экстраклеточную, а С-конец внутриклеточную локализацию [11, 12] (рис.2).

Сдоам Oprnon m Piwmeooeg»

Рис.2. Структура G-белок связанных рецепторов

Долгое время считалось, что основной функцией опиоидных рецепторов является регулирование болевых ощущений, однако позднее стало известно, что эти рецепторы вовлечены и в другие биологические процессы, такие, как миоз, брадикардия, гипотермия, депрессия сгибательных рефлексов, модуляция эндокринных процессов и иммунной системы. Таким образом, исследование механизмов активации опиоидной системы представляется весьма актуальным не только для создания новых лекарственных препаратов, но и для объяснения разных биологоческих механизмов.

Используемые в настоящее время в клинической практике опиоидные препараты, несмотря на огромный анальгезирующий потенциал, не могут быть использованы в течение длительного времени для купировании хронической боли, так как обладают весьма губительными побочными эффектами, такими как угнетение дыхания [1, 2], дисфункция кишечника, физическая зависимость и толерантность [3,4].

Как известно, длительное воздействие агонистом сопровождается снижением числа рецепторов-мишеней (down regulation), формированием состояния толерантности, под которым понимают ослабление анальгезирующего действия опиоидов, их эйфоригенных и седативных эффектов. Одновременно, эти соединения влияют на ряд физиологических процессов, в особенности на регуляцию температуры тела и дыхательную функцию [10]. Вследствие развития толерантности для получения нужного эффекта приходится увеличивать дозу опиоида, но это, в свою очередь, чревато разными побочными эффектами. Таким образом, развивается порочный круг: с одной стороны, необходимо увеличивать дозу для получения анальгезирующего эффекта, с другой вследствие увеличения дозы развиваются побочные эффекты.

Для создания опиоидных препаратов с минимальными побочными эффектами применяются разные подходы, одним из которых является создание таких лигандов, которые могут связываться с более чем одним опиоидным рецептором. С двумя рецепторами одновременно могут взаимодействовать лиганды с двумя активными функциональными группами. Такие лиганды называются бивалентными. Они состоят из двух функционально активных участков-фармакофоров, и участка, связывающего эти фармакофоры линкерный участок [20]. Бивалентные лиганды бывают двух типов: гомобивалентные, когда два фармакофора имеют идентичную структуру, и гетеробивалентные структуры фармакофоров различны [21].

Мишенью для бивалентных лигандов являются димерные рецепторы, однако до настоящего времени димеризация опиоидных рецепторов и роль димеризации в сигнальной трансдукции остается темой для активной дискуссии, так как точки зрения ученых по этому поводу различны. Одни считают, что родопсиноподобные рецепторы не существуют в виде димеров [14], другие что они функционально активны именно в димерном состоянии [15].

Для создания функционально активных димеров и изучения возможности их взаимодействия с бивалентными лигандами подходящим инструментом является метод компьютерного молекулярного моделорования. Сочетание экспериментальных исследований и данных молекулярного моделирования может дать возможность разрабатки реалистических моделей лиганд-рецепторных комплексов, позволяющих охарактеризовать такие данные как аффинность лиганда, селективность, а также определить локализацию лиганд связывающего кармана и точные участки лиганд-рецепторного взаимодействия.

В настоящее время методы молекулярного моделирования широко используются для исследования структурно-функциональных взаимосвязей в биомолекулах, для поиска новых лекарственных препаратов, исследования свойств отдельных молекул и их ансамблей.

После того, как стали известны кристаллические структуры многих О-белок связанных рецепторов, а совсем недавно, и кристаллическая структура опиоидных рецепторов [16, 17, 18], стало возможным компьютерное моделирование динамики взаимодействия опиоидных рецепторов с соответствующими лигандами.

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Для молекулярного моделирования динамики взаимодействия опиоидных рецепторов с лигандами нами использовались программные пакеты Charmm и Rosetta. Для работы были выбраны ци 5-опиоидные рецепторы, так как, согласно данным литературы, при активации ц-рецептора и одновременной блокировке 5рецептора можно достичь более выраженного и пролонгированного анальгетического эффекта, при этом значиткльно снижается развитие толерантности.

На первом этапе нами была предпринята попытка моделирования динамики взаимодействия ц-опиоидного рецептора с классическим агонистом морфином. Данное взаимодействие было проведено для валидации метода. Для достижения данной цели был использован программный пакет Charmm.

Для проведения исследования была использована кристаллическая структура ц-рецептора [16]. Данная структура представляет собой «химерный» рецептор, большая часть которого соответствует ц-опиоидному рецептору, однако, третья цитоплазматическая петля заменена белком T4-L, более того, отсутствуют участки N-и C-концов. Молекулярное моделирование динамики взаимодействия ц-опиоидного рецептора с морфином показало, что лиганд заходит в кармашек рецептора, но не образует связи с ним. В дальнейшем мы удалили T4L из структуры рецептора, который в данном случае выполнял роль фиксатора, затем с помощью программного пакета Charmm часть рецептора была зафиксирована в точке asp 147. Выше данной точки рецептор оставался свободным, а ниже фиксированным, т.е. эта часть не участвовала в процессе моделирования. Однако конечный результат не изменился, т.е. взаимодействия не произошло. Исходя из результатов эксперимента, была выдвинута гипотеза, согласно которой, отсутствие взаимодействия может быть связано с отсутствием полной структуры рецептора. С помощью программного пакета Rosetta мы попытались достроить недостающие участки рецептора.

Кристаллическая структура 5-рецептора была получена аналогичным путем, т.е. также в виде «химерной» структуры, с соотвествующими недостающими участками и с белком T4-L. Так как взаимодействия данного рецептора с соответствующим антагонистом также не произашло, мы решили достроить его в соответствии с ц-рецептором.

На основании полученных результатов в дальнейшем будет сконструирован функционально активный ц-5-гетеродимер [19], после чего мы надеемся произвести моделирование взаимодействия полученного гетеродимера с бивалентным лигандом MDAN-21 с целью выявления в дальнейшем определенных корреляционных взаимоотношений между структурой и фармакологической активностью различных соединений. Результаты планируемых исследований могут послужить основой для создания новых высокоэффективных обезболивающих препаратов, лишенных нежелательных побочных эффектов

ВЫВОДЫ

Существующая кристаллическая структура ци 5-опиоидных рецепторов не подходит для молекулярного моделирования.

Недостающие участки рецепторов выполняют определенную роль в

лиганд-рецепторном взаимодействии.

ЛИТЕРАТУРА

Zaki P.A., Bilsky E.J., Vanderah T. W., Lai J., Evans C.J., Porreca F. Opioid receptor types and subtypes: the delta receptor as a model. Annual Rev Pharmacol Toxicol, 36, 379-401 (1996).

Loh H., Smith A. Molecular characterization of opioid receptors. Annual Rev of Pharmacology, 30, 123-170 (1990).

Simon E. Opioid receptors and endogenous opioid peptides. Medical research reviews, 11, 357-374 (1991).

Wolleman M. Recent developments in the research of opioid receptor subtypes molecular characterization. Journal of Neurochemistry, 54, 1095-1101 (1990).

MacDonald R.L., Nelson P.G. Specific opiate-induced depression of transmitter release from dorsal root ganglion cells in culture. Science (Washington DC), 199, 1449-1451 (1978).

Mudge A., Leeman S.E., Fischbach G.D. Enkephalin inhibits the release of substance P from sensory neurons in culture and decrease action potential duration. Proceedengs of the National Academy of Science(USA), 76, 526-530 (1979).

Yaksh T.L. The spinal action of opioids. In:Herz,A, ed. Handbook of experimental pharmacology.Opioids II.Berlin: Springer-Verlag, 53-90 (1993).

Hughes J., Smith T., Kosterlitz H., Forthergill L., Morgan B., Moris H. Identification of two related pentapeptides from the brain with potent opiate agonist activity. Nature (London), 258, 577—579 (1975).

Pasternak G., Simantov R., Snyder S. Characterization of an endogenous morphine-like factor (enkephalin) in mammalian brain. Molecular Pharmacology,12, 504-513 (1976).

Kieffer B.L. Recent advances in molecular recognition and signal transduction of active peptides: receptors for opioid peptides. Cell Mol Neurobiol, 15, 615-635 (1995).

Waldhoer M., Bartlett S.E., Whistler J.L. Opioid receptors. Annu Rev Biochem, 73, 953990 (2004).

Pasternak G. Multiple opiate receptors: dejavu all over again. Neuropharmacology, 47, 312-323 (2004).

Vaccarino A.L., Kastin A.J. Endogenous opiates: 2000. P eptides, 22, 2257-2328 (2001).

Chabre M., M. le Maire. Monomeric G-protein-coupled receptor as a functional unit. Biochemistry, 44, 9395-9403 (2005).

Fotiadis D. Structure of the rhodopsin dimer: a working model for G-protein-coupled receptors.Curr Opin Struct Biol, 16, 252-259, (2006).

Manglik A., Kruse A.C. Crystal structure of the ^-opioid receptor bound to a morphinan antagonist. Nature. 21, 321-326 (2012).

Granier S., Manglik A. Structure of the 5-opioid receptor bound to naltrindole. Nature. 16, 400-404 (2012).

Wu H., Wacker D. Structure of the human K-opioid receptor in complex with JDTic. Nature, 21, 327-332 (2012).

Ananthan S. Opioid ligands with mixed mu/delta opioid receptor interactions: an emerging approach to novel analgesics. AAPS J ,8, 118-125 (2006).

Portoghese P.S. Bivalent ligands and the message-address concept in the design of selective opioid receptor antagonists. Trends Pharmacol Sci, 10, 230-235 (1989).

Peng X., Knapp B.I., Bidlack J.M., Neumeyer J.L. Pharmacological properties of bivalent ligands containing butorphan linked to nalbuphine, naltrexone, and naloxone at mu, delta, and kappa opioid receptors. J Med Chem, 50, 2254-2258, (2007).

MOLECULAR MODELING OF INTERACTION DYNAMICS OF ^-, 8OPIOID RECEPTORS WITH CORRESPONDING AGONISTS AND

ANTAGONISTS

L.R. Nikoghosyan, G.R. Aslanyan, G.S.Vardanyan, K.B.Nazaryan

The aim of this research is to create new bivalent opioid receptor ligands with minimal side effects For designing new ligands with improved properties, we used the method of molecular modeling. In this case, first of all attempted to model the dynamics of the interaction of ^ opioid receptor with a classic agonist-morphine, and modeling the dynamics of the interaction of 5-opioid receptor and its antagonist naloxone.

Поступила 04.12.2012 г.

УДК 577.37

THE EFFECT OF 8HZ MECHANICAL VIBRATION ON HELIX POMATIA HEART MUSCLE

Naira S. Baghdasaryan

Life Science International Postgraduate Educational Center e-mail arian_serg@yahoo. com

Abstract.It was shown that treatment of physiological solution by mechanical vibration decreased the H2O2 content (by 5±0.9%) which was accompanied by increasing of 45Ca efflux (by 322±16%), elevating of intracellular level of cyclic GMP (by 53±7%) and decreasing the intracellular level of cyclic AMP (by 84±7%) in Helix pomatia heart muscle samples.

On the basis of obtained data it was suggested that mechanical vibrationinduced effect on heart muscle is due to the decreases of H2O2 content in the medium, which leads to the elevation of 45Ca extrusion from heart muscle cells in result of activation of cyclic GMP-dependent Na+/Ca2+ exchange in forward regime. Also it was established that the mechanism of 8Hz mechanical vibration-induced effect on heart muscle of snail is similar to 4Hz-induced one but in more pronounced manner.

Key words: 8Hz, mechanical vibration, H2O2, Ca efflux, cyclic GMP

Introduction

In previous works in our laboratory it was shown that the effect of 4Hz mechanical vibration (MV) on physicochemical properties of water (Akopian and Ayrapetyan 2005) is accompanied by the decrease of H2O2 content in it. Also it was established the cellular pathway through which 4Hz MV-induced effect on Helix pomatia heart contractility could be realized (Dadasyan et al. 2012). Therefore, it was suggested that H2O2, which is ROS (reactive oxygen species), having the longest lifetime, could serve as a messenger through which the modulating effect of 4Hz on heart muscle is realized. The subsequent experiments on frequency-dependent effect of MV on physiological solution (PS) showed that 8Hz-induced effect was more obvious in comparison with the 4Hz-induced one (Baghdasaryan et al. 2012). Therefore, it is necessary to evaluate the impact of the 8Hz MV on heart muscle, as well as to clarify the possible differences between 4 and 8 Hz-induced impact mechanisms.

As intracellular cyclic AMP (cAMP)and cyclic GMP (cGMP)-dependent Ca2+ transports have a crucial role in the regulation of muscle contractility, consequently the effect of 8Hz MV-treated PS on 45Ca efflux, intracellular cGMP and cAMP contents were studied.

Material and Methods

The 8Hz treatments of PS samples

A special device was assembled, which allowed treating the PS by MV in range of 1-20Hz frequency as described in Dadasyan et al. 2012.

Measurement of 45Ca efflux by heart muscles cells

Before the 45Ca efflux measurement the heart muscle samples (control and experimental) were enriched by 45Ca radionuclide during 60 min incubation in K-free, 50% Na (replaced by equal osmotic concentration sucrose) PS containing 0.45 mCi/l 45Ca (having specific activity 5mCi/mg, Amersham Life Science production). To remove the 45Ca from the extracellular spaces the heart muscles samples were washed three times with K-free, 50% Na PS and incubated for 15 min in control and 8Hzpretreated normal PS (45Ca radioisotopes-free). Then each sample was homogenized in 50 ^l 68% HNO3 solution, after which 3 ml of Bray’s scintillation fluid was added, and then the radioactivity of samples was counted by Wallac 1450 liquid scintillation and luminescent counter (Wallac Oy, Turku, Finland).

Measurement of intracellular levels of cyclic AMP and cyclic GMP

The measurements of intracellular cAMP or cGMP contents of heart muscle samples after their 15 min incubation in control and MV-pretreated PS were performed by radioimmunoassay methods using commercially available kits: cyclic AMP (3H) assay system and cyclic GMP (3H) assay system, correspondingly (Amersham International plc, Amersham, Bucks; UK). Heart samples were deproteinized by “simple buffer extraction” method before using in the cAMP or cGMP assays.

Statistical analysis

The Sigma-Plot (Version 8.02A) was used for the data analysis. The mean value and standard error of 45Ca efflux, the intracellular cAMP and cGMP contents were calculated. The statistical probability was expressed in figures with the help of asterisks (*).

Results and Discussion

The modern molecular models of water suggest that at room temperature 7580% of water is associated with three or four neighboring water molecules, yielding an extensive three-dimensional network forming the water clusters (Chaplin 2011). Because of the brief duration (a time scale of 10-11 sec) of these bounds the number of water molecules in clusters is changing and water remains liquid. Therefore, such quasi steady state of water structure makes it extra sensitive to weak physical and chemical signals, including MV at IS frequency, which is able to modulate the process of water molecules clustering. The water clustering structure predicts the existence of frequency windows, at which the MV at IS frequency could stabilize or destroy the water structure.

Previous experiments in our center were shown that 4 Hz MV have stabilized the water structures (Akopian and Ayrapetyan 2005) as well as decreased the H2O2 content in PS. Later findings on the frequency-dependent effect of MV on PS were shown that 8Hz MV brings to the decrease of the H2O2 formation in PS stronger than 4Hz MV. Since the H2O2 serves as a powerful modulator for cell metabolic activity (Schroder and Eaton 2008, Hunanyan and Ayrapetyan 2007), the MV-induced decrease of H2O2 content in cell bathing medium could be suggested as a potential messenger through which the biological effects of MV on cells and organisms are realized.

Fig. 1 The effect of 15 min 8Hz MV-treated PS on 45Ca efflux from heart muscle cells (expressed in %, as compared to control) **P<0.001

As intracellular Ca2+ ions have a crucial role in the regulation of muscle contractility the MV-treated PS effect on the 45Ca efflux from the heart muscle was studied. The data presented in Fig. 1 show that MV-treated PS activated the 45Ca efflux from the muscle cells by 322±16%.

It is known that there are two mechanisms for Ca2+ extrusion from the cell: the Na+/Ca2+ exchanger and the plasma membrane Ca2-ATPase pump (Blaustein and Lederer 1999). Both are intracellular cGMP-dependent (Azatyan et al. 1998) mechanisms, while the Na+/Ca2+ exchange in reversal mode is activating by intracellular cAMP (Saghyan et al. 1996). Therefore, the impacts of MV-treated PS on intracellular contents of cAMP and cGMP of heart muscles were the subjects of our study also.

As it can be seen in Fig. 2a, the intracellular level of cGMP was increased (by 53±7%) while the cAMP was decreased (by 84±7%) in muscles as a result of bathing hearts samples by 15 min MV-treated PS (Fig. 2b).

It is known that H2O2-induced activation of muscle contraction is due to activation of cAMP dependent Ca infflux (Lin et al. 2007, Saghyan et al. 1996). The obtained data in present work about MV-treated PS activation effect on 45Ca efflux from cells (Fig. 1), which was accompanied by the decrease of intracellular level of cAMP and the increase of cGMP (Fig. 2a, 2b), could be explained by the activation of cGMP-dependent electrogenic Na+/Ca2+ exchanger in regime of 1Ca2+ efflux, 3Na+ influx as well as by the activation of cGMP-dependent Ca2-ATP-ase pump (Azatian et al. 1997, Brini and Carafoli 2011). However, we need more detailed investigations to finalize this reasoning.

+ a

Control MV-treated    Control MV-treated

Fig. 2a and 2b The effect of 15 min 8Hz MV-treated PS on the intracellular levels of cGMP (2a) and cAMP (2b) in heart muscle cells of Helix pomatia (expressed in %, as compared to control) *P<0.05

Conclusion

The obtained data allow us to come to the following conclusions;

The 8Hz MV-induced decrease of H2O2 formation in aqua medium causes the activation of cGMP-dependent Na+/Ca2+ exchanger in forward mode (3Na+ influx and 1Ca2+ efflux)

The mechanism of 8Hz MV-induced effect on Helix pomatia heart muscle is similar to 4Hz-induced one but in more pronounced manner.

REFERENCES

Akopian S., Ayrapetyan S. A study of the specific conductivity of water exposed to constant magnetic field, electromagnetic field, and low-frequency mechanical vibration. Mol. Biophys. 50, 255-259 (2005).

Azatian K.V., Ayrapetyan S.N., Carpenter D.O. Metabotropic GABA Receptors Regulate Acetylcholine Responses on Snail Neurons. Gen. Pharmacol. 29(1), 67-72 (1997).

Azatyan K., White A., Walker R., Ayrapetyan S. Cellular and molecular mechanisms of nitric oxide induced heart muscle relaxation. Gen Pharmacol 30, 543-553 (1998).

Baghdasaryan N., Mikayelyan Y., Barseghyan S., Dadasyan E., Ayrapetyan S. “The modulating impact of illumination and background radiation on 8Hz-inducrd infrasound effect on physicochemical properties of physiological solution”, Electromagnetic Biology and Medicine, (2012).

Blaustein M.P, Lederer W.J. Sodium.Calcium Exchange: Its Physiological Implications. Physiol. Rev. 79, 763-854 (1999)

Brini M., Carafoli E. The Plasma Membrane Ca2+ ATPase and the Plasma Membrane Sodium Calcium Exchanger Cooperate in the Regulation of Cell Calcium. Cold Spring Harb Perspect Biol. February 1, 3:a004168 (2011)

Chaplin M.F. Water Structure and Behavior. Available via (2011)

Dadasyan E., Ayrapetyan G., Baghdasaryan N., Mikayelyan Y., Ayrapetyan S. "The metabolic pathway of 4Hz infrasound effect on snail heart muscle contractility", The Environmentalist, 32(2), 166-174 (2012).

Hunanyan A., Ayrapetyan S. The dose-dependent effect of hydrogen peroxide on neuromembrane chemosensitivity. Electromagn. Biol. Med. 26, 225-233 (2007).

Lin M.J., YangX.R., Cao Y.N., Sham J.S. Hydrogen peroxide-induced Ca2+ mobilization in pulmonary arterial smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 292, 15981608 (2007).

Saghyan A.A., Ayrapetyan S.N., Carpenter D.O. Low dose of ouabain stimulates the Na:Ca exchange in helix Pomatia neurons. Cell Molec. Neurobiol., 16(4), 489-498 (1996).

Schroder E., Eaton P. Hydrogen peroxide as an endogenous mediator and exogenous tool in cardiovascular research: issues and considerations. Curr. Opin. Pharmacol. 8(2), 153-159 (2008).

Материал взят из журнала Вестник выпуск Физико-математические и естественные науки