Материалы и методика исследований. Крысы

Исследование выполнено на 22 самцах крыс массой 250-300 г., содержащихся в стандартных условиях. С помощью стереотаксической установки животным опытной группы (5 крыс) в правый боковой желудочек вводили 10 мкл липополисахарида (ЛПС) Е.соїі («Sigma», USA) в «малой» дозировке (концентрация 0,1 мкг/мкл). 6 крыс получали «большую» дозу ЛПС (0,25 мкг/мкл). Контрольной группе (11 крыс) вводили 10 мкл стерильного забуференного физиологического раствора. Через 3 дня после введения фиксировали мозговую ткань с помощью интракардиальной перфузии. Далее проводили иммуногистохимическое окрашивание фронтальных и сагиттальных криостатных срезов мозга толщиной 14 мкм с целью выявления различных клеточных популяций пролиферативной зоны. Для выявления клеток использовали первые антитела к РЭФР, НАМ, ИЛ-1 (Sigma, USA), MHCII(Santa-Cruse, USA) и вторые антитела, конъюгированные с ФИТЦ и ТРИТЦ (Sigma, USA). Гистологические препараты исследовали в люминесцентный микроскоп «NikonEclipse Е200», количество иммунопозитивных клеток на стандартной площадке и интенсивность свечения анализировали при помощи компьютерной программы обработки изображений «ImageProPlus 6.0». Обработку микрофотограмм осуществляли в программе «AdobePhotoshop CS6». Статистическую обработку проводили в программе «Statistica 6.0». Для сравнения групп выборок высчитывали для них значения «среднее арифметическое ± стандартная ошибка средней». Достоверность различий между средними значениями оценивали с помощью t критерия Стьюдента.

Результаты и их обсуждение

Изучение срезов контрольной группы животных с помощью люминесцентного микроскопа продемонстрировало наличие стволовых, полустволовых и нейробластных клеток в латеральной суб-вентрикулярной зоне мозга крыс. Окрашивание срезов мозга антителами к нестину (маркеру нейро-генных стволовых В-клеток) выявляло иммунопозитивные клетки вблизи от стенки второго желудочка мозга (рис.1а). Они характеризовались низкой плотностью упаковки в среднем на одну сторону среза толщиной 14 мкм приходилось от 8 до 12 клеток. Это наблюдение соответствует информации о том, что стволовые клетки составляют незначительную часть клеточной популяции и для них характерна низкая пролиферативная активность [1].

Окрашивание срезов антителами к РЭФР(рецептор эпидермального фактора роста) позволило выявить в СВЗ транзиторные прогинеторные клетки (полустволовые) типа С (рис.1г). На одной стороне среза насчитывалось от 18 до 36 РЭФР-иммунопозитивных клеток. Известно, что эти активно пролиферирующие полустволовые клетки служат предшественниками нейробластов [1].

Нейробласты (А-клетки), иммунопозитивные к НАМ (нейрональная адгезионная молекула), располагались на сагиттальных срезах мозга в виде цепочек, ориентированных в ростральном направлении, преимущественно параллельно стенке второго желудочка (рис. 1ж). Подобная ориентация может свидетельствовать о миграционной активности нейробластов. Действительно, данные литературы свидетельствуют о том, что нейробласты, генерируемые в СВЗ, активно мигрируют в обонятельные доли мозга, образуя так называемый «ростральный миграционный поток» [6].

При изучении срезов экспериментальной группы крыс с внутрижелудочковым введением ли-пополисахарида обнаружились изменения в клеточном составе нейрональных предшественников по сравнению с контрольными животными, причем характер изменений зависел от концентрации вводимого в желудочек ЛПС. Так, внутрижелудочковое введение ЛПС в концентрации 0,1 мкг/мкл привело к снижению количества клеток, иммунопозитивных к нестину (в среднем на 11,1% по сравнению с контролем), однако эти различия не достигали достоверного уровня (рис.1б; 2). Тенденция к снижению наблюдалась и в отношении полустволовых клеток (С тип), иммунопозитивных к РЭФР (рис. 1д). Подсчет клеток данной популяции на репрезентативных уровнях продемонстрировал уменьшение их количества по сравнению с контролем в среднем на 8,4%, но и это снижение не достигало достоверного уровня (рис. 2). В то же время падение количества нейробластов (А-клеточный тип) после введения этой дозы ЛПС было значительным. Подсчет клеток на репрезентативных уровнях показал их достоверное снижение в среднем на 51,3% (р<0,01) (рис. 1з; 2).

Рис. 1. Уменьшение количества клеток в субвентрикулярной зоне (выделена на схеме прямоугольником) иммунопозитивных к нестину (В-клетки) после введения малой (б) и большой (в) доз ЛПС по сравнению с контролем (а), рецепторам эпидермального фактора роста (С-клетки) после введения малой (д) и большой (е) доз ЛПС по сравнению с контролем (г), нейрональным адгезионным молекулам (А-клетки) после введения малой (з) и большой (и) доз ЛПС по сравнению с контролем (ж): 2ж второй желудочек мозга, СТ-стриатум (полосатое тело). Длина линии = 150 мкм

Введение в желудочки ЛПС в концентрации 0,25 мкг/мкл вызывало угнетение процесса нейро-генеза, характеризующееся достоверным снижением количества стволовых, полустволовых и бласт-ных клеток (рис. 1в, е, и; 2). Так, количество стволовых клеток, иммунопозитивных к нестину, уменьшалось по сравнению с контролем на 66,7% (р<0,001), а количество полустволовых клеток, иммунопозитивных к РЭФР, снижалось в среднем на 60,9% (р<0,001). Нейробласты оказались наиболее чувствительными к воздействию липополисахарида, так как достоверное уменьшение их количества, наблюдаемое уже после введения малой дозы ЛПС, было еще более значительным после введения эндотоксина в дозе 0,25 мкг/мкл. Количество этих клеток составило примерно 9,5 % от их количества в контроле, причем в некоторых случаях введение высокой дозы ЛПС приводило к полному исчезновению иммунопозитивных к НАМ клеток (рис. 1и; 2).

Рис. 2. Падение количества клеток в субвентрикулярной зоне мозга, иммунопозитивных к нестину, РЭФР (рецепторам к эпидермальному фактору роста), НАМ (нейрональной адгезионной молекуле) после внутрижелудочкового введения ЛПС различной концентрации: * р<0,01; ** р<0,001 относительно контроля

Таким образом, мы обнаружили негативный дозозависимый эффект бактериального эндотоксина на процесс нейрогенеза в СВЗ. Наиболее чувствительными к действию липополисахарида оказались нейробласты, число которых достоверно редуцировалось в условиях, когда стволовые и полустволовые клетки еще не проявляли выраженной негативной реакции. Однако высокая доза вводимого в желудочки мозга крыс ЛПС приводила к значительной редукции клеток всех популяций, что свидетельствует об угнетении репаративных свойств мозга в условиях интенсивного воспаления.

Для определения возможных молекулярных и клеточных механизмов, которые могут быть вовлечены в опосредование негативных влияний на нейрогенные клетки бактериального эндотоксина, мы исследовали реакцию микроглии в моделируемых условиях. Было обнаружено, что введение ЛПС в концентрации 0,1 мкг/мкл вызывало активацию микроглиоцитов в СВЗ, что выражалось в увеличении ими экспрессии иммунореактивных молекул MHCII (в среднем на 88,6 %; р<0,001 по сравнению с контролем) и индукции синтеза провоспалительного цитокина ИЛ-1. Введение более высокой дозы ЛПС вызывало более значительные изменения экспрессии молекул МНС II (в среднем на 169,7%; р<0,001; рис. 3).

Рис.3. Увеличение экспрессии микроглиоцитами молекул МНСІІ через 3 дня после внутрижелудочкового введения физиологического раствора (а) и липополисахарида в малой (б) и большой (в) концентрации: СТ стриатум. Длина линии = 90 мкм

Эндотоксин может активировать микроглию, связываясь с Toll-4 подобными рецепторами на ее поверхности [7; 8].Известно, что в активированной микроглии индуцируется синтез провоспалитель-ных цитокинов [9; 10] и цитотоксических факторов, действие которых может вести к повреждению нейронов путем усиления окислительного стресса и активации механизмов, приводящих к клеточной гибели [11]. Вероятно, ЛПСактивированная микроглия может схожим образом повреждать и вызывать гибель нейрогенных клеток в СВЗ. Подтверждением предположения о ключевой роли микроглии в угнетении нейрогенеза после ЛПС-индуцированного нейровоспаления могут служить результаты исследования другой нейрогенной области мозга гиппокампа, продемонстрировавшие отрицательную корреляциию между числом активированной микроглии и числом выживших новообразованных нейронов в этой области [12]. Вместе с тем следует учитывать и возможность прямого воздействия ЛПС на нейрогенные клетки, поскольку на них также обнаружены Toll-4 подобные рецепторы [8].

Выводы

1. Через три дня после введения бактериального эндотоксина в желудочки мозга крыс микро-глиоциты латеральной субвентрикулярной зоны дозозависимым образом увеличивали интенсивность экспрессии молекул MHC II и провоспалительного цитокина ИЛ-1.

2. Через три дня после внутрижелудочкового введения бактериального эндотоксина в концентрации 0,1 мкг/мкл в латеральной субвентрикулярной зоне достоверно снижалось количество клеток типа А. Введение ЛПС в концентрации 0,25 мкг/мкл вызывало достоверное снижение количества всех типов нейрогенных клеток (В, С, А). Таким образом, введение ЛПС дозозависимым способом нарушает самообновление, выживаемость, миграцию и дифференцировку нейрогенных стволовых клеток.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Викторов И.В. Стволовые клетки мозга млекопитающих: биология стволовых клеток invivo и invitro // Изв. АН. Серия биологич. 2001. №6. С. 646-655.

2. Patrick J. Bernier, Jonathan Vinet. Characterization of the subventricular zone of the adult human brain: evidence for the involvement of Bcl-2 // Neuroscience Research. 2000. Vol. 37. P.67-78.

3. Gianvito M., Stefano P. The therapeutic potential of neural stem cells // Nature Reviews Neuroscience. 2006. Vol. 7, № 5. Р. 395-406.

4. Пальцев М.А., Тверских В.В., Васильев А.В. Что есть стволовая клетка // Биология стволовых клеток и клеточные технологии. 2009. Т. 1. С. 13-30.

5. Russo I., Barlati S., Bosetti F. Effects of neuroinflammation on the regenerative capacity of brain stem cells // J. Neurochem. 2011. Vol. 116, №6. Р. 947-956.

6. Fiona D., Jose M., Arturo A. Regeneration of a germinal layer in the adult mammalian brain // Neurobiology. 1999.

Vol. 96. Р. 11619-11624.

7. Beutler B. Inferences, questions and possibilities in Toll-like receptor signalling. // Nature. 2004. Vol. 430.

P. 257-263.

8. Rolls A., Shechter R., London A., Ziv Y., Ronen A., Levy R., Schwartz M. Toll-like receptors modulate adult hip-pocampal neurogenesis // Nat Cell Biol. 2007. Vol. 9, №9. Р. 1081-1088.

9. Perry V.H. The influence of systemic inflammation on inflammation in the brain: implications for chronic neurodegenerative disease // Brain Behav. Immun. 2004. Vol. 18. P. 407-413.

10. Liu B., Hong J.S. Role of microglia in inflammation-mediated neurodegenerative diseases: mechanisms and strategies for therapeutic intervention // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2003. Vol. 304. P. 1-7.

11. Zhou C., Zhang C., Chi S., Xu Y., Teng J., Wang H., Song Y., Zhao R. Effects of human marrow stromal cells on activation of microglial cells and production of inflammatory factors induced by lipopolysaccharide // Brain Res. 2009. Vol. 1269. P. 23-30.

12. Monje M.L., Toda H., Palmer T.D. Inflammatory blockade restores adult hippocampal neurogenesis // Science. 2003. Vol. 302, № 5651. Р. 1760-1765.

Поступила в редакцию 29.12.12

T.N. Sergeeva, A.A. Stenkina, O.A. Vezheeva, V. G. Sergeev

Dose-dependent effect of bacterial lipopolysaccharide on neurogenesis in the lateral subventricular brain zone of adult rats

We investigated the effects of intraventricular administration of different doses of bacterial lipopolysaccharide (LPS) on the cellular composition in the lateral subventricular zone of the adult rat’s brain. The results of immunohistochemical studies have demonstrated dose-dependent decrease in cell number of different populations of neuronal precursors, selectively immunopositive for nestin, epidermal growth factor or neuronal adhesion molecules. In addition, administration of LPS increased in a dose-dependent manner the expression of MHC II and pro-inflammatory cytokine IL-1in microglial cells.

Keywords: lateral subventricularzone, lipopolysaccharide, neuralstem cells, neuroinflammation, microglia.

Cергеева Татьяна Николаевна, старший преподаватель E-mail:

Стенькина Анастасия Анатольевна, студентка E-mail:

Вежеева Ольга Александровна, аспирант E-mail:

Сергеев Валерий Георгиевич, доктор биологических наук, профессор

E-mail:

ФГБОУ ВПО «Удмуртский государственный университет» 426034, Россия, г. Ижевск, ул. Университетская, 1 (корп. 1)

Sergeeva T.N., senior lecturer E-mail:

Stenkina A.A., student E-mail:

Vezheeva O.A., graduate lecturer E-mail:

Sergeev V.G., doctor of biology, professor E-mail:

Udmurt State University

426034, Russia, Izhevsk, Universitetskaya st., 1/1

Материал взят из книги Биология. Науки о земле