ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ПОЛИМОРФНЫХ ВАРИАНТОВ ГЕНОВ VKORC1, CYP2C9, CYP4F2, GGCX, PROC, F VII НА ДОЗУ

ВАРФАРИНА СРЕДИ ЖИТЕЛЕЙ ЗАПАДНОСИБИРСКОГО РЕГИОНА РОССИИ

Л. А. Белозерцева, Е. Н. Воронина, Н. А. Кох, Г. И. Лифшиц,

М. Л. Филипенко

Научный руководитель: канд. биол. наук Е. Н. Воронина

Новосибирский государственный университет, г. Новосибирск

Введение. Варфарин – клинически эффективный, широко применя емый оральный антикоагулянт для лечения и предотвращения тромбо зов различной этиологии. Молекулярной мишенью варфарина является фермент – витамин Кэпоксидредуктаза (VKOR). Роль этого фермента в каскаде свертывания крови – восстановление окисленного витамина К, необходимого для карбоксилирования четырех факторов свертывания (II, VII, IX и X). Варфарин ингибирует восстановление витамина К и тем самым блокирует каскад свертывания крови. Этот препарат имеет узкий

терапевтический индекс и широкую межиндивидуальную изменчивость в дозах препарата для достижения целевого лечебного эффекта [1].

Большое количество исследований направлено на определение вклада различных факторов, опосредующих реакцию пациентов при приеме варфарина. На сегодняшний день описано несколько генетиче ских маркеров, ассоциированных с вариабельностью дозы варфарина, среди которых наибольший вклад (2030%) вносят полиморфные варианты гена VKORC1. На дозу варфарина также влияет активность его ме таболизма ферментом CYP2C9 (до 15% изменчивости). Несколько по лиморфных вариантов гена CYP2C9 идентифицированы как уменьшаю щие активность фермента, что приводит к увеличению концентрации

варфарина в плазме крове и развитию геморрагий различной степени тяжести. Помимо этих двух генов рассматриваются и другие гены, кодирующие белки, участвующие в реализации действия варфарина – GGCX (гаммаглутимил карбоксилаза), PROC (белок C), FVII (VIIй фактор свер тывания крови), CYP4F2 (цитохром 4F2). В различных исследованиях было показано, что 23% изменчивости в дозе может объясняться нали чием полиморфных замен в гене GGCX, 79% в гене PROC, 4% в гене CYP4F2, 1% в гене FVII [1,2,3]. Среди негенетических предикторов значимый вклад в межиндивидуальную изменчивость дозы был показан

для возраста около 79%, пола до 2% и массы тела – примерно 6%

[1,4]. Изученные частоты встречаемости этих вариантов, а также сте пень их влияния на индивидуальную дозу варфарина среди представи телей различных рас и популяций существенно различаются. Таким об разом, большой интерес для применения варфарина в лечебной практи ке представляет исследование факторов, влияющих на индивидуальную дозу варфарина для регионов и популяций России.

Цель работы. Целью нашей работы было исследование влияния полиморфных вариантов генов VKORC1 (1173 C>T, rs9934438), CYP2C9 (*2, *3), GGCX (12970 C>G, rs11676382), PROC (2583 A>T, rs1799810), FVII (10976 G>A, rs6046), CYP4F2 (23454 G>A (V433M), rs2108622) и не генетических параметров на вариабельность дозы варфарина среди жи телей ЗападноСибирского региона России.

Материал и методы. В группу пациентов, принимающих варфарин (95 человек), вошли больные, проходившие лечение в Центре Новых Медицинских Технологий в г. Новосибирске. У всех пациентов на протя жении периода лечения измерялось международное нормализованное отношение. В группе из 95 человек было 36% женщин, 64% мужчин; воз раст больных составлял от 16 до 76 лет, в среднем – 52,9 лет. Подбор дозы для достижения целевых значений МНО осуществлялся эмпириче ским путем.

ДНК выделяли из венозной крови с использованием стандартной процедуры, включающей выделение и лизис клеток крови, гидролиз

белков протеиназой К, очистку ДНК экстракцией примесей фенолхлороформом и осаждение ДНК этанолом.

Определение генотипов полиморфных локусов проводилось мето дом ПЦР в режиме реального времени с использованием конкурирую щих TaqMan зондов, комплементарных полиморфной последовательно сти ДНК.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы Statistica for Windows, v.8 (StatSoft, Inc.). Тест на соблюде ние равновесия ХардиВайнберга проводили с помощью программы DeFinetti на сайте Института генетики человека (Мюнхен, Германия; http://ihg2.helmholtzmuenchen. de/cgibin/hw/hwa1.pl)

Результаты и обсуждение. Полученные в нашей выборке частоты аллелей соответствовали распределению ХардиВайнберга. Доза варфарина значимо различалась среди носителей разных генотипов по по лиморфным вариантам генов VKORC1 (1173 C>T) и CYP2C9 (аллель *3

– 42614 A>C) (p=0,0000 и p=0,018 соответственно). Для носителей гено типа C/C полиморфного локуса 1173 C>T гена VKORC1 (N=41) средняя доза составляла 6,25 мг/день, C/T (N=44) 5,0 мг/день, T/T (N=8) 2,81 мг/день. Для носителей генотипа A/A полиморфного локуса 42614 A>C (*3) гена CYP2C9 (N=86) – 5,0 мг/день, A/C – 3,1 мг/день. Для этих полиморфных вариантов проводился линейный регрессионный анализ, где зависимым признаком выступала доза варфарина, а предиктором – генотип. Полученные в результате анализа коэффициенты детерминации говорили о том, что полиморфный вариант 1173 C>T гена VKORC1 объ ясняет 19,51% межиндивидуальной изменчивости в дозе препарата; а аллель*3 гена CYP2C9 – 3,6% (p=0,000006 и 0,036276 соответственно).

Для остальных исследуемых полиморфных вариантов не было выявле но значимых ассоциаций с дозой варфарина (CYP2C9*2 (р=0,5204), GGCX 12970 C>G (р=0,2919), PROC 2583 A>T (р=0,6613), FVII 10976

G>A (р=0,4724), CYP4F2 23454 G>A (р=0,0697))

Затем в различные множественные регрессионные модели для оценки совместного влияния признаков поочередно включали значимые

генетические предикторы, а также возраст и пол пациентов. По отдельности возраст и пол не достигали статистической значимости в качестве предикторов дозы, но при добавлении данных о поле в модель с VKORC1 1173 C>T, CYP2C9*3 наблюдалось наибольшее значение ко эффициента детерминации 19,58 % при pvalue модели <0,00005.

Выводы.

1. Среди исследованных полиморфных вариантов генов в нашей вы борке значимое влияние на дозу варфарина имели VKORC1 1173

C>T и CYP2C9*3.

2. Одномерный регрессионный анализ показал, что VKORC1 1173

C>T вносит 19,51%, а CYP2C9*3 3,6% изменчивости в дозе вар

фарина в нашей выборке. Полученная множественная регрессион ная модель, включающая в себя VKORC1 1173 C>T, CYP2C9*3 и данные о поле пациентов, объясняла 19,58% изменчивости в дозе варфарина.

Список литературы:

1. Mia Wadelius, Leslie Y. Assocition of warfarin dose with genes involved in its action and metabolism.// Hum Genet (2007); Vol. 121, pp. 23–34.

2. Cen HJ, Zeng WT. CYP4F2 rs2108622: a minor significant genetic factor of warfarin dose in Han Chinese patients with mechanical heart valve replacement.// Br J Clin Pharmacol. (2010) Aug; 70(2), pp. 23440.

3. Aquilante CL, Langaee TY. Influence of coagulation factor, vitamin K epoxide reduc tase complex subunit 1, and cytochrome P450 2C9 gene polymorphisms on warfarin

dose requirements.// Clin Pharmacol Ther. (2006) Apr; 79(4), pp. 291302.

4. Mia Wadelius, Ly Chen et al. Common VKORC1 and GGCX polymorphisms associ ated with warfarin dose. // The Pharmacogenomics Journal (2005); Vol. 5, pp. 262–

270.

Материал взят из: Медикобиологические науки: достижения и перспективы (г. Томск, 10-11 ноября 2011 г.): сборник материалов I Всероссийской научной студенческой конференции