ФИТАЗЫ МИКРООРГАНИЗМОВ КАК ОСНОВА НОВЫХ БИОУДОБРЕНИЙ ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ РОСТА РАСТЕНИЙ

Использование фитаз для замены фосфорных удобрений вызвано тем, что запасы фосфатов исчерпаемы. Фитазы бацилл отличаются от фитаз почвенных грибов и могут быть широко использованы в биотехнологии. Гены фитаз бацилл высоко гомологичны между собой, но гомологии с генами фитаз других микроорганизмов не обнаружено. Был получен штамм B. subtilis с инактивированным геном фитазы, который в отличие от дикого штамма не стимулирует прорастание семян кукурузы (Zea mays).

Поддержание высоких урожаев сельскохозяйственных культур, необходимое для обеспечения продовольствием растущего населения Земли, поддерживается благодаря массированному применению минеральных удобрений. Фосфорные удобрения получают, разрабатывая залежи горных пород, богатых фосфатами. Однако запасы фосфатов на Земле — это фактически невозобновляемые и исчерпаемые ресурсы [Gilbert, 2009]. Именно поэтому необходимо искать альтернативные использованию фосфорных удобрений пути обеспечения сельскохозяйственных растений фосфором.

В почве органическая форма фосфора представлена в основном в виде фитиновой кислоты и ее солей — фитатов. Они составляют почти 50% от общего органического фосфора и более 80% от общего фосфора в кормах растительного происхождения [Richardson et al., 2005].

Рисунок 1 — Фитиновая кислота [В. Г. Карцев, 2003].

Фитиновая кислота — это специфическое химическое соединение шестиатомного спирта инозитола, по гидроксильным радикалам которого прикреплено 6 остатков молекул фосфорной кислоты. Остатки фосфорной кислоты химически активны, поэтому с ними связываются ионы металлов — кальций, натрий, калий, цинк, медь — а также остатки аминокислот. Таким образом, фитаты связывают не только фосфор, но и значительную часть микроэлементов, белков, аминокислот, углеводов, превращая их в комплексный нерастворимый конгломерат.

Существует особая группа фосфатаз, способных гидролизовать фитат с образованием инозитола и доступных солей фосфорной кислоты. Слабая активность фермента обнаружена в корнях растений, которые не способны секретировать фитазу в ризосферу. Это означает, что корни растений не способны получать фосфор напрямую из фитатов почвы. Установлено, что

внеклеточные фитазы почвенных микроорганизмов способны расщеплять фитаты и переводить фосфор и связанные ионы металлов в доступное для растений состояние [Makarewicz et al., 2006].

Несмотря на то, что фитазы некоторых почвенных микроорганизмов выделены и описаны, история фитаз еще далека от завершения. Максимально подходящие для использования в сельском хозяйстве фитазы до сих пор отсутствуют. Поэтому ведется постоянный поиск новых продуцентов фитаз.

Следует отметить, что фитазы бацилл отличаются от фитаз почвенных грибов нуклеотидной последовательностью гена, характеристиками фермента и способом гидролиза субстрата. В связи с чем, бациллярные ферменты имеют высокий потенциал для использования в качестве биоудобрений для сельскохозяйственных растений. Проводили сравнительный анализ генов фитаз бактерий рода Bacillus, представленных в базе данных сервера NCBI. Структурная гомология генов фитаз Bacillus subtilis и B. amyloliquefaciens составляет 100%, Bacillus subtilis и B. licheniformis — 73%. Сравнительный анализ структуры гена phyC Bacillus subtilis с генами фитаз грибов (Aspergillus sp.) и грам-отрицательных бактерий (Pseudomonas sp., Klebsiella sp., Echerichia) не выявил гомологии, тогда как внутри рода грибов гомология генов фитаз Aspergillus niger, Aspergillus ficuum (phy A) и Aspergillus awamori составляет 92%.

Для выяснения роли фитазы Bacillus subtilis в жизнедеятельности бацилл, включая стрессовые состояния, а также влияния фитаз на координированное потребление фосфатов сельскохозяйственными растениями, проводили инактивацию гена, кодирующего фитазу (phyC) в геноме B. subtilis. Для этого проводили трансформацию линейного фрагмента ДНК, включающего ген устойчивости к эритромицину (em) и фланкированного 5‘ и 3‘ областями гена фитазы (phyC), в компетентные клетки B. subtilis. В результате гомологичной рекомбинации по участкам гомологии с хромосомной ДНК бактерии происходило встраивание в геном гена устойчивости к антибиотику.

 

Бактерии начинают синтезировать фитазу в стационарной фазе роста. Мы исследовали характер накопления фитазной активности исходным штаммом B. subtilis по сравнению с нокаутированным штаммом B. subtilis dPHY (рисунок 2). Штамм B. subtilis dPHY не проявляет активности по отношению к специфическому субстрату, в отличие от контрольного штамма B. subtilis. Это является биохимическим доказательством отсутствия активного гена фитазы в клетках штамма B. subtilis dPHY.

Рисунок 2 — Активность мутантного штамма B. subtilis dPHY (опыт) и дикого штамма B. subtilis

(контроль) по гидролизу фитата.

Штамм B. subtilis dPHY с нокаутированным геном фитазы не имеет существенных морфологических отличий по сравнению с исходным штаммом: клетки и мутантного, и дикого штамма представляют собой палочки, как одиночные, так и собранные в цепочки.

В лабораторных опытах изучили влияние мутантного и дикого штаммов B. subtilis на прорастание семян кукурузы (Zea mays). На питательных средах, содержащих фитат натрия в качестве единственного источника фосфора, положительный эффект на прорастание семян отмечался при их обработке суспензией дикого штамма B. subtilis, тогда как dPHY штамм не оказывал стимулирующего эффекта.

Несмотря на то, что растения разработали многочисленные механизмы для увеличения доступности фосфора почвы, утилизация растениями фосфора из почвенных фитатов незначительна, что связано с низкой фитазной активностью в ризосфере растений.

Два гена фитазы были клонированы из кукурузы, но ферменты, кодируемые этими генами, не секретируются [Richardson et. al., 2005]. Из-за отсутствия внеклеточной фитазной активности, растения не могут самостоятельно гидролизовать фитаты почвы. Однако трансгенные растения Arabidopsis, экспрессирующие внеклеточную фитазу Aspergillus, смогли самостоятельно удовлетворять свои потребности в фосфоре непосредственно из фитатов почвы [Mudge et al.,

2003]. Такой же опыт провели и с зерновыми культурами: генетически модифицированные растения Trifolium subterraneum L. секретируют фитазу (PhyA) A. niger прямо из своих корней [George et al., 2005].

Установлено, что добавление очищенной фитазы к ризосфере способствует утилизация фосфора из почвенных фитатов, подчеркивая, таким образом, важность этого фермента в питании растений. Положительный результат активности бактериальной фитазы в ризосфере состоит так же в элиминации хелатообразующих фитатов, которые связывают важные для растений минералы и микроэлементы.

В Германии в группе профессора Rainer Borriss были получены доказательства того, что фитазная активность, которая присутствует в культуральной жидкости ризобактерий Bacillus amyloliquefaciens FZB45, способствует росту семян кукурузы в условиях фосфатного голодания и в присутствии фитата в среде [Borriss et. al., 2002]. Использование культуральной жидкости в качестве биоудобрения является экономически выгодным, экологичным способом сокращения использования фосфорных удобрений.

Эти данные позволяют сделать вывод, что фитаза относится к факторам, способствующим улучшению роста и физиологических параметров растений. Положительный результат действия

бактериальной фитазы в ризосфере растений состоит в гидролизе хелатообразующих фитатных комплексов, которые связывают и делают недоступными для растений важные минералы и микроэлементы. Таким образом, применение фитаз позволит существенно сэкономить энергетическое пространство в рационе, сократить степень обогащения почвы минеральными добавками и представляет новый качественный этап совершенствования эффективности агропроизводства и сокращения затрат удобрений на единицу сельскохозяйственной продукции.

Материал взят из: Казанская наука. №1. 2010г