ФАКТОРЫ, МОДУЛИРУЮЩИЕ АПОПТОЗ ТЛИМФОЦИТОВ

В. Д. Якушина, М. В. Белкина, А. Н. Марошкина, Е. В. Кайгородова, О. А. Васильева

ГОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России (г. Томск)

Введение. Программированная клеточная гибель имеет большое значение в поддержании го меостаза иммунной системы. Нарушение работы механизмов регуляции апоптоза лежит в основе раз вития многих заболеваний [1]. В связи с этим, для разработки новых терапевтических подходов, представляет интерес изучение механизмов модуляции апоптоза. Одним из апоптозрегулирующих факторов является белок теплового шока 90 (HSP90), увеличение содержания которого наблюдается во многих опухолевых клетках [2].

Цель. Изучить факторы, модулирующие апоптоз Тлимфоцитов здоровых доноров и клеток линии Jurkat.

Материал и методы. Мононуклеарные лейкоциты здоровых доноров и клетки Тлимфобластной лейкемии человека линии Jurkat (институт цитологии РАН, СанктПетербург) куль тивировали суспензионным методом с добавлением в среду 30 нг/мл рекомбинантного TNFα и 5мкМ ингибитора HSP90 17AAG. Через 18 часов инкубации оценивали содержание апоптотически изме ненных клеток по связыванию аннексинаV, меченного FITC, и пропидий йодида на флуоресцентном микроскопе Carl Zeiss («Abcam», UK). Изменение трансмембранного потенциала митохондрий ис следовали через 18 часов с помощью набора реагентов BD Biosciences (США) на проточном цито

метре (BD FACSCalibur Flow Cytometer, США). Активность каспазы8 и 3 определяли фотоколори метрическим методом через 2 и 3 часа инкубации, соответственно. Контрольную группу составили интактные клетки.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием непараметрического кри терия МаннаУитни с учетом поправки Бонферрони.

Результаты и обсуждение. В клетках линии Jurkat при добавлении rTNFα и 17AAG отмечал ся достоверно более высокий уровень апоптоза, по сравнению с остальными условиями культивиро вания (р<0,05). Так содержание апоптотически измененных клеток при совместном действии rTNFα

и ингибитора HSP90 составило 88,68 (67,7993,85)%, что было в 18 раз выше аналогичного показате ля, полученного при исследовании интактных клеток, и в 3,5 раза выше, чем при действии rTNFα

или 17AAG. Полученные результаты, возможно, связаны с тем, что HSP90 стабилизирует транс крипционные факторы RIP, Akt и NFκB, активируемые сигналами от TNFα и приводящие к повыше нию жизнеспособности клеток [2].

При определении количества мононуклеарных лейкоцитов здоровых доноров в состоянии апоптоза, достоверных различий между группами с добавлением rTNFα и 17AAG или одного из

препаратов выявлено не было (р>0,05). Отсутствие цитотоксического эффекта 17AAG на мононук леарные лейкоциты здоровых доноров, может говорить о том, что HSP90 в нормальных клетках не обладает значительным апоптозрегулирующим действием, как в опухолевых. Разный апоптогенный

эффект ингибитора HSP90 в исследованных клетках, вероятно, связан с особенностями строения и внутриклеточного содержания данного белка. Например, известно, что в трансформированных клетках HSP90 находится в мультишаперонном комплексе с высокой АТФазной активностью, который не характерен для нормальных клеток.

Ингибирование HSP90 в опухолевых клетках с помощью 17AAG приводило к статистически

значимому увеличению активности каспазы8 (р<0,05). Исходя из этого, можно предположить, что белок теплового шока HSP90 влияет на активацию инициаторной каспазы8. Так как активность кас пазы8 при совместном действии на клетки rTNFα и 17AAG достоверно не отличалась от изучаемо го параметра при добавлении одного из препаратов, можно предположить, что HSP90 напрямую ин гибирует превращение прокаспазы8 в активную форму.

Активности каспазы3 в клетках линии Jurkat достоверно увеличивалась при добавлении 17AAG (р<0,05). Причем активность каспазы3 увеличивалась в большей степени при ингибировании

HSP90 без индуктора апоптоза, чем при совместном действии rTNFα и 17AAG. Это может быть свя зано с неоднозначной ролью TNFα в запуске программированной клеточной гибели [3].

Количество клеток линии Jurkat с деполяризованной митохондриальной мембраной было дос товерно выше как при совместном действии 17AAG и rTNFα, так и при добавлении одного из пре паратов, по сравнению с интактными клетками (р<0,05). Следовательно, белок теплового шока

HSP90 может влиять на целостность мембраны митохондрий.

Заключение. В результате исследования было выявлено, что белок теплового шока 90 прини мает участие в регуляции апотоза опухолевых клеток. Ингибирование HSP90 увеличивает чувствительность клеток линии Jurkat к апоптозу, индуцированному TNFα, приводит к активации каспазы8

и 3 и деполяризации митохондриальной мембраны. На мононуклеарные клетки здоровых доноров ингибитор 17AAG не оказывает проапоптотического эффекта.

Список литературы:

1. Sun Y., Peng Z. L. Programmed cell death and cancer // Postgrad Med J. – 2009. – № 1001. – С. 134140.

2. Gallegos R. M., Floor K., Roepman P. et al. Integration of gene dosage and gene expression in nonsmall cell lung cancer, identification of HSP90 as potential target // Giaccone GPLoS One. – 2008. – №5. – P.

63–71.

3. G. V. Georgakis, Y. Li, G. Z. Rassidakis et al. Inhibition of Heat Shock Protein 90 function by 17 Allylamino 17DemethoxyGeldanamycin in Hodgkin’s Lymphoma Cells DownRegulates Akt Kinase,

Dephosphorylates Extracellular Signal Regulated Kinase, and Induces Cell Cycle Arrest and Cell Death

// Clin Cancer Res. – 2006. – Vol. 12, № 2. – Р. 584590.

Материал взят из: Науки о человеке: Сборник статей по материалам XII Российского конгресса молодых ученых с международным участием (Томск, 26-27 мая 2011 г.)