ЭКСПРЕССИЯ РЕЦЕПТОРОВ К ТРАНСФОРМИРУЮЩЕМУ ФАКТОРУ РОСТА β1 В СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКЕ БРОНХОВ ПРИ ТЯЖЕЛОЙ ФОРМЕ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЫ И ХРОНИЧЕСКОЙ ОБСТРУКТИВНОЙ БОЛЕЗНИ ЛЕГКИХ

А. А. Силютина

Научный руководитель: канд. мед. наук, доц. Е. А. Геренг

Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск

Введение. Морфологическая оценка изменений, развивающихся в бронхолегочной системе при том или ином патологическом процессе служит основой для понимания закономерностей компенсаторно приспособительных и дезадаптивных процессов в органах дыхания [1].

По результатам последних исследований тяжелая форма бронхи альной астмы (БА) и хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) составляют от 5 до 20% в общей структуре всех болезней органов дыха ния, сопровождаясь высокой частотой жизнеугрожающих обострений и смертностью пациентов [2].

Воспаление дыхательных путей является чрезвычайно сложным регуляторным механизмом и протекает с участием активированных имму нокомпетентных клеток ростовых факторов, цитокинов, каскадные взаи модействия которых с окружающими структурами приводят к характер ным патоморфологическим и патофизиологическим проявлениям забо леваний [5].

Предпосылкой для проведения данной работы послужили противо речивые данные о взаимосвязи трансформирующего фактора роста β1 (TGFβ1) и его значение в формировании ремоделирования бронхиаль ной стенки при тяжелых формах БА и ХОБЛ.

Цель исследования: показать роль экспрессии рецепторов к TGF β1 на клетках бронхиального эпителия и макрофагах (МФ) собственной пластинки слизистой оболочки бронхов на примере тяжелой формы бронхиальной астмы и хронической обструктивной болезни легких.

Материал и методы. Материалом исследования явились биоптаты слизистой оболочки правого среднедолевого бронха полученные во время бронхоскопии у пациентов с тяжелой формой БА (n=27) и ХОБЛ (n=49).

Бронхобиоптаты проводили через смесь абсолютизированного изо пропанола и Тритона Х15, заливали в парафин по стандартной методи ке. Иммуногистохимическое исследование биоптатов слизистой оболочки бронхов (СОБ) осуществляли с помощью антител фирмы

«Novocastra» TGFβ1 (клон TGFβ17, рабочее разведение 1:40) согласно инструкции предлагаемой производителями данной тестсистемы. Экс прессию TGFβ1 на МФ оценивали на 1 мм2 ткани собственной пластинке слизистой оболочки бронхов. Экспрессия рецепторов к TGFβ1 в эпите

лиоцитах СОБ оценивали по интенсивности окраски срезов с помощью люминесцентного микроскопа "Люмам И3" с фотометрической насадкой ФМЭЛ2. Фотометрирование проводили в 50 клетках реснитчатого эпи телия слизистой оболочки бронхов при длине волны монохроматическо го света 548 нм (зеленый).

Статистическую обработку проводили при помощи пакета программ

Statistica 6.0. Данные представляли в виде медианы (Me). Меру рассея ния в виде квартильного интервала (Q0,25Q0,75).

Результаты и обсуждение. При иммуногистохимическом исследовании бронхобиоптатов обнаружено, что рецепторы к TGFβ1 представ лены на клетках бронхиального эпителия и МФ собственной пластинки СОБ. Содержание трансформирующего фактора роста β1 в бронхиаль ном эпителии в усл. ед. 0,587 (0,4370,625) при тяжелой форме бронхи альной астмы, 0,382 (0,1240,486) при тяжелой форме хронической об структивной болезни легких. Плотность макрофагов, экспрессирующих рецепторы к трансформирующего фактора роста β1 в 1 мм2 ткани брон хов 149,25 (123,82159,94) при тяжелой форме бронхиальной астмы,

441,82 (378,94482,34) при тяжелой форме хронической обструктивной болезни легких.

При тяжелой форме БА, по сравнению с ХОБЛ, в собственной пластинке СОБ обнаружено повышение уровня рецепторов к TGFβ1 на клетках реснитчатого эпителия, что приводит к усилению функциональ ной активности фибробластов и тучных клеток, сопровождающееся субэпителиальным фиброзом и увеличением базальной мембраны. Ве роятно, усиление высвобождения TGFβ1 из клеток эпителия бронхов приводит к утолщению базальной мембраны, посредством усиления продукции коллагена I, III, VIII, осуществляемой фибробластами и ком понентов основного вещества (фибронектина, тенасцина), синтезируе мых лаброцитами [4]. Фиброз базальной мембраны является важным патогенетическим механизмом эпителиальномезенхимальных измене ний, приводящих к развитию выраженной бронхиальной гиперреактив ности [3].

Тяжелая форма ХОБЛ, напротив, отличалась более высокими пока зателями плотности МФ, экспрессирующих рецепторы к анализируемо му ростовому фактору в 1 мм2 , собственной пластинке СОБ. Макро фагальные клетки у пациентов с ХОБЛ локализовались вокруг сосудов в СОБ. Обнаруженный нами факт у пациентов с тяжелой формой ХОБЛ приводил к развитию фиброза собственной пластинке СОБ с преимуще ственной периваскулярной локализацией. Это реализовывалось в необ ратимой бронхиальной обструкции и эндотелиальной дисфункцией, сопровождающееся утяжелением течения ХОБЛ [4].

Выводы.

1. Повышение содержание трансформирующего фактора роста β1 в клетках реснитчатого эпителия у пациентов с тяжелой формой брон хиальной астмы приводило к выраженному субэпителиальному фиброзу и утолщению базальной мембраны.

2. Более высокая плотность макрофагов, экспрессирующих рецеп торы к трансформирующему фактору роста β1, у пациентов с тяжелой формой ХОБЛ сопровождалась фиброзом собственной пластинки слизистой оболочки бронхов с преимущественной периваскулярной локали зацией.

Список литературы:

1. Непомнящих, Г. И. Биопсия бронхов: морфогенез общепатологических процес сов в легких / Г. И. Непомнящих. – М.: Издво РАМН, 2005. – 405 с.

2. Barnes P. J. Chronic Obstructive Pulmonary Disease / P. J. Barnes // The New Eng land Journal of Medicine. – 2000. – Vol. 343. – P. 269280.

3. Holgate, S. T. The Epithelium and airway remodelling // Eur. Respir. J. – 2007. – Vol.

29. –дение. При иммуногистохимическом исследовании бронхобиоптатов обнаружено, что рецепторы к TGFβ1 представ лены на клетках бронхиального эпителия и МФ собственной пластинки СОБ. Содержание трансформирующего фактора роста β1 в бронхиаль ном эпителии в усл. ед. 0,587 (0,4370,625) при тяжелой форме бронхи альной астмы, 0,382 (0,1240,486) при тяжелой форме хронической об структивной болезни легких. Плотность макрофагов, экспрессирующих рецепторы к трансформирующего фактора роста β1 в 1 мм2 ткани брон хов 149,25 (123,82159,94) при тяжелой форме бронхиальной астмы,

441,82 (378,94482,34) при тяжелой форме хронической обструктивной болезни легких.

При тяжелой форме БА, по сравнению с ХОБЛ, в собственной пластинке СОБ обнаружено повышение уровня рецепторов к TGFβ1 на клетках реснитчатого эпителия, что приводит к усилению функциональ ной активности фибробластов и тучных клеток, сопровождающееся субэпителиальным фиброзом и увеличением базальной мембраны. Ве роятно, усиление высвобождения TGFβ1 из клеток эпителия бронхов приводит к утолщению базальной мембраны, посредством усиления продукции коллагена I, III, VIII, осуществляемой фибробластами и ком понентов основного вещества (фибронектина, тенасцина), синтезируе мых лаброцитами [4]. Фиброз базальной мембраны является важным патогенетическим механизмом эпителиальномезенхимальных измене ний, приводящих к развитию выраженной бронхиальной гиперреактив ности [3].

Тяжелая форма ХОБЛ, напротив, отличалась более высокими пока зателями плотности МФ, экспрессирующих рецепторы к анализируемо му ростовому фактору в 1 мм2 , собственной пластинке СОБ. Макро фагальные клетки у пациентов с ХОБЛ локализовались вокруг сосудов в СОБ. Обнаруженный нами факт у пациентов с тяжелой формой ХОБЛ приводил к развитию фиброза собственной пластинке СОБ с преимуще ственной периваскулярной локализацией. Это реализовывалось в необ ратимой бронхиальной обструкции и эндотелиальной дисфункцией, сопровождающееся утяжелением течения ХОБЛ [4].

Выводы.

1. Повышение содержание трансформирующего фактора роста β1 в клетках реснитчатого эпителия у пациентов с тяжелой формой брон хиальной астмы приводило к выраженному субэпителиальному фиброзу и утолщению базальной мембраны.

2. Более высокая плотность макрофагов, экспрессирующих рецеп торы к трансформирующему фактору роста β1, у пациентов с тяжелой формой ХОБЛ сопровождалась фиброзом собственной пластинки слизистой оболочки бронхов с преимущественной периваскулярной локали зацией.

Список литературы:

1. Непомнящих, Г. И. Биопсия бронхов: морфогенез общепатологических процес сов в легких / Г. И. Непомнящих. – М.: Издво РАМН, 2005. – 405 с.

2. Barnes P. J. Chronic Obstructive Pulmonary Disease / P. J. Barnes // The New Eng land Journal of Medicine. – 2000. – Vol. 343. – P. 269280.

3. Holgate, S. T. The Epithelium and airway remodelling // Eur. Respir. J. – 2007. – Vol.

29. –енных после химической конверсии ДНК образцов, в pGEM®T Easy Vector (Promega, USA) и последующего секвенирования ДНКвставок методом Сенгера.

Результаты и обсуждение. Для последующего анализа были приготовлены образцы циркулирующей ДНК из крови 20 здоровых по

медицинским показаниям доноров, 20 больных раком предстательной железы (РПЖ) и 20 больных гиперплазией предстательной железы

(ДГПЖ). Поскольку циркулирующие ДНК сильно фрагментированы, нами был разработан метод осаждения низкомолекулярной ДНК ацетоном в присутствие гликогена. Поскольку известно, что фрагменты ДНК, циркулирующие в крови имеют как тупые, так и выступающие концы,

полученные препараты концентрированной ДНК были обработаны T4

DNA polymerase (New England Biolabs, USA) для «тупления» концов ДНК. Адапторы были лигированы при помощи Т4 DNA ligase. После обработки метилспецифичными эндонуклеазами рестрикции и ПЦР в присутствие флуоресцентно меченых трифосфатов образцы были проанали зированы при помощи микрочипов. На основании результатов Human CpG island microarray исследования было отобрано 13 фрагментов ДНК

с различным уровнем метилирования у здоровых и больных доноров. Анализ результатов пиросеквенирования 13 фрагментов во всех 60 образцах показал достоверные различия в уровнях метилирования CpG динуклеотидов у ЗД и больных РПЖ в 2х из 13ти исследованных фрагментов. Причем в пределах одного фрагмента ДНК присутствуют как цитозины, уровень метилирования которых достоверно различается, так и цитозины со сходным уровнем метилирования у ЗД и больных РПЖ. Для того чтобы выяснить механизм формирования общего пула метилированных ДНК и вклада случайного метилирования было отсе квенировано не менее чем по 100 клонов от исследуемых пациентов.

Секвенирование отдельных молекул показало, что у здоровых доноров большая часть CpGдинуклеотидов метилирована в исследованном фрагменте гена RNF219. В отличие от здоровых доноров часть циркули рующих в крови больных раком предстательной железы фрагментов данного гена полностью неметилирована. При этом часть молекул имеет профиль метилирования аналогичный тому, который наблюдается в крови здоровых доноров, а молекулы с «промежуточным» типом мети лирования отсутствуют.

Выводы:

1. Подготовлены образцы внеклеточной ДНК крови 60 пациентов.

2. Исследованы различия в уровнях метилирования внеклеточной ДНК

здоровых доноров, больных РПЖ и больных ДГПЖ при помощи микро чипов.

3. По данным пиросеквенирования в пределах одного ДНКмаркера присутствуют как CpGдинуклеотиды с достоверно различающимся уровнем метилирования между здоровыми и больными донорами, так и CpGдинуклеотиды с одинаковым уровнем метилирования

4. Данные о секвенировании отдельных молекул циркулирующих ДНК методом Сенгера показали, что пул цирулирующей ДНК формируется из здоровых тканей и больных, случайного метилирования нет, а следовательно этот ген может быть использован в диагностике рака предста тельной железы.

5. Обнаруженное деметилирование некоторых позиций CpGдинуклеотидов, повидимому, принципиально для регуляции экспрессии гена.

Список литературы:

1. Van der Vaart M., Pretorius P. J. Is the role of circulating DNA as a biomarker of cancer being prematurely overrated? // Clinical Biochemistry. – 2010. – N. 43. – P.

2636.

2. Jung K., Fleischacker M., Rabien A., Cellfree DNA in the blood as a solid tumor bi omarker – A critical appraisal of the literature // Clinica Chimica Acta. – 2010. – N.

411. – P. 16111624.

Материал взят из: Медикобиологические науки: достижения и перспективы (г. Томск, 10-11 ноября 2011 г.): сборник материалов I Всероссийской научной студенческой конференции