ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКАЯ ПАСПОРТИЗАЦИЯ ПЕРЕВИВАЕМОЙ ЛИНИИ КЛЕТОК ПОЧКИ СВИНЬИ (СПЭВ)

В. Н. СТЕФАНОВА

ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных Россельхозакадемии»

Введение. В настоящее время в биологических и медицинских ис — следованиях широко используют перевиваемые линии клеток, полу — ченные от домашних животных. Следует отметить, что культивирова — ние одних и тех же штаммов клеток в разных лабораторных условиях на протяжении многих лет приводит к возникновению различий в их культуральных, морфологических и кариологических свойствах. По — этому возникает необходимость повсеместного проведения паспорти- зации каждой перевиваемой линии и последующего распространения их эталонных образцов из специализированных коллекций клеточных культур животных и человека [1].

Перевиваемая линия клеток СПЭВ была получена в 1959 г. в Мос — ковском научно-исследовательском институте вирусных препаратов из почки эмбриона свиньи. Штаммы этой линии используются во многих институтах: МГУ, Институт биоорганической химии РАН, Институт цитологии РАН, Институт медицинской приматологии РАМН, ВНИИ экспериментальной ветеринарии Россельхозакадемии. Однако цитогене — тическая паспортизации и реконструкция модального кариотипа штам — мов этой линии не проводилась.

Цель работы – получить цитологические препараты штамма линии СПЭВ из Российской коллекции клеточных культур позвоночных Ин — ститута цитологии РАН (Санкт-Петербург) и провести их цитогенетиче — скую паспортизацию.

Материал и методика исследований. Размороженные клетки ли- нии СПЭВ культивировали в питательной среде DMEM или RPMI

1640 с 10 % фетальной сыворотки (Биолот), 1 % DMSO и гентамици — ном (50 мкг/мл). Для приготовления препаратов хромосом использова- ли клетки на 2-е сутки после пересева. Колцемид в концентрации

0,05 мкг/мл добавляли в культуру клеток за 1,5 часа до окончания

культивирования. С подложки клетки снимали смесью трипсин-версен (1:1), при этом время обработки контролировали под лупой. В даль — нейшем использовали стандартную методику приготовления цитоло-

XIX Международная научно-практическая конференция

Жодино – Горки

гических препаратов хромосом. Полученные препараты использовали для определения изменчивости числа хромосом клеток линии СПЭВ и выявления модального кариотипа (анализировали 100 метафазных пластинок, окрашенных рутинным способом). Для определения доли полиплоидных клеток в выборку включали 1000 метафазных пласти — нок. Для идентификации хромосом клетки окрашивали GTG-методом. Анализировали препараты на микроскопе Axio Imager A1 (Zeiss). Ис — пользовали полуавтоматический вариант классификации хромосом свиньи программы Карио-3.1, в анализ брали 25 дифференциально ок — рашенных метафаз с модальным кариотипом.

Результаты исследований. Подсчет числа хромосом на рутинно окрашенных препаратах линии СПЭВ (штамм 28194) показал незначи — тельную вариабельность клеток по числу хромосом с четко выражен — ным модальным классом. При этом клетки модального класса с чис — лом хромосом 40 составляли 84 % популяции клеток, а интервал из — менчивости не превышал 7 хромосом. Доля полиплоидных клеток, представленных тетраплоидными, составила 1,5 %. Идентификацию хромосом клеток линии СПЭВ проводили на GTG-окрашенных хромо — сомах. Было установлено, что среди 40 хромосом модального кариоти — па клеток линии СПЭВ 9 хромосом являются результатом сложных перестроек хромосом нормального кариотипа свиньи: 5 из них пред — ставлены субметацентриками и 4 – акроцентриками. Следует отме — тить, что перестройки затронули преимущественно акроцентрические хромосомы свиньи: из 6 пар акроцентриков стандартного кариотипа свиньи 7 хромосом были вовлечены в перестройки. Отмечена трисо — мия по 4-й хромосоме свиньи, которая была характерна для всех 25 проанализированных нами хромосомных наборов клеток линии СПЭВ. Таким образом, как следует из полученных нами данных, модальный кариотип клеток линии СПЭВ представлен 30 субметацентрическими хромосомами и 10 акроцентрическими. Реконструированный кариотип штамма линии СПЭВ из Российской коллекции клеточных культур по — звоночных (ИНЦ РАН) может быть представлен следующим образом:

40,XX,–1,+4,der(6)(6pter→6q23::?),

der (13)(13cen→13q11::? →13q41::?16q11→16q23::?), der(14)(14cen→14q27), –15,der(15;?(? →?q10::15q10→15qter),–16, der(17;?)(? →?q10::17q10→17qter),–18,+15mar, mar2:der(?)(?→?cen::?1q11→1q18::?), mar3:der(?16)(?16cen→16q21::?::?p13→1pter),mar5:der(?18). Заключение. Исследования, проведенные на линии клеток СПЭВ,

подтверждают основные закономерности кариотипической эволюции

Cовременные тенденции и технологические инновации в свиноводстве

4–6 октября 2012 г.

клеток в культуре, среди которых сбалансированность хромосомного набора клеток, сохранение как минимум дисомии по всем аутосомам, постоянство либо минимальная изменчивость числа и распределения ядрышкообразующих районов (ЯОР) в хромосомах данной линии, экс — тракопирование целых хромосом [2]. Вместе с тем для нее не харак — терна утрата в процессе культивирования одной из половых хромосом: модальный кариотип клеток СПЭВ содержит две половые Х хромосо — мы. Уникальность исследованного нами штамма клеток СПЭВ касает — ся обнаруженной амплификации рибосомной ДНК одного из гомоло- гов хромосомы 8, которая проявляется в виде значительного гетеро — морфизма ЯОР на хромосомах этой пары. Подобного паттерна распре — деления ЯОР по двум парам хромосом свиньи не выявлено ни в одном из описанных до настоящего времени штаммов линии СПЭВ из раз — ных лабораторий [3, 4, 5]. Таким образом, характер окрашивания се — ребром ядрышкообразующих хромосом можно считать уникальной характеристикой данного штамма клеточной линии [2]. С помощью рутинного окрашивания было показано, что модальное число хромо — сом в штамме клеток СПЭВ из ВИЭВ было равно 39 [6]. Следует от — метить интересный феномен, описанный в клетках линии СПЭВ, по — лученных из Москвы в 1964 году и до 1985 года сохраняющих нор — мальное диплоидное число хромосом свиньи, несмотря на воздействие ряда мутагенных факторов [5]. Таким образом, эта линия клеток на протяжении 25 лет представляла собой уникальный пример как среди перевиваемых линий свиньи, так и перевиваемых клеточных линий, полученных от разных видов животных и человека. Впоследствии в этой линии клеток возникли три маркерные хромосомы, число хромо — сом в этой линии уменьшилось до 35 и до 60 % возросло число поли- плоидных клеток. Постепенно клон клеток с 35 хромосомами вытеснял остальные клоны, рост клеток ухудшился, и в 1994 году эта популяция клеток окончательно погибла. В дальнейшем планируется провести идентификацию маркеров и производных хромосом штамма клеток СПЭВ с помощью флуоресцентной гибридизации in situ, используя хромосом специфичные пейнтинговые пробы свиньи, что позволит окончательно определить все произошедшие в культуре кариотипиче — ские изменения.

ЛИТЕРАТУРА

1. Д ь я к о н о в, Л. П. Животная клетка в культуре / Л. П. Дьяконов. – М., 2000. – 400 с.

2. М а м а е в а, С. Е. Закономерности кариотипической эволюции клеток в культуре / С. Е. Мамаева // Цитология. – 1996. – Т. 38. – С. 787–814.

XIX Международная научно-практическая конференция

Жодино – Горки

3. Ультраструктура, форма и число фибриллярных центров в клетках Go-периода ткани почки эмбриона свиньи / П. Гозак [и др.] // Цитология. – 1983. – Т. 25. – С. 1236–1242.

4. Ядрышкообразующие районы в хромосомах перевиваемых культур клеток / А. А. Царева [и др.] // Вопросы вирусологии. – 1986. – Т. 31. – С. 712–717.

5. Karyotype evolution of the established RES (Ren Embryonis Suis) cell line / D. Dzieka-nowska [et al.] // J. Appl. Genet. – 1995. – Vol. 36. – P. 177–185.

6. Цитогенетическая характеристика клеток линии СПЭВ и двух производных от нее линий гибридных клеток / Н. М. Тергалинская [и др.] // Современные достижения и про — блемы биотехнологии сельскохозяйственных животных: материалы 6-й междунар. конф.

– Дубровицы, 2006. – С. 179–182.

Материал взят из: Современные тенденции и технологические инновации в свиноводстве: матер. XIX Международной науч.-практ. конф Горки, 4–6 октября 2012 г.