АКТУАЛЬНЫЕ ПРОБЛЕМЫ БИОТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ДОИМПЛАНТАЦИОННЫХ ЭМБРИОНОВ СВИНЕЙ IN VITRO

Т. И. КУЗЬМИНА, Г. В. МУРЗА, Д. А. НОВИЧКОВА

ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных Россельхозакадемии»

Введение. Необходимость интенсификации технологии получения эмбрионов свиней in vitro вызвана активизацией внедрения клеточных репродуктивных технологий в животноводство, биомедицину, фарма — кологию [1, 2]. В дополнение к использованию свиньи как объекта жи — вотноводческой продукции гаметы sus scrofa domesticus используют как источник получения трансгенных, клонированных животных, соз — дания линий эмбриональных стволовых клеток. Получение доимплан — тационных эмбрионов свиней in vitro – базовая технология для совер — шенствования и интенсификации внедрения инновационных клеточ — ных репродуктивных технологий в свиноводство. Отбор перспектив — ных для дальнейшего созревания и оплодотворения донорских ооци-

Cовременные тенденции и технологические инновации в свиноводстве

4–6 октября 2012 г.

тов – начальный этап, определяющий эффективность технологии. Морфологические критерии оценки качества женской гаметы недоста — точно информативны, так как выход доимплантационных эмбрионов свиней из оцененных таким способом ооцитов не превышает 30 %. Поиск эффективных маркеров ядерно-цитоплазматического созрева — ния свиных ооцитов, детерминирующих проспективные потенции к развитию из них эмбрионов, – актуальная проблема биотехнологии получения эмбрионов свиней in vitro. Использование красителя ВСВ (brillant cresyl blue – бриллиантовый кристаллический голубой) позво — ляет тестировать растущие и завершившие стадию роста ооциты. BСB является витальным красителем, который детерминирует внутрикле — точную активность глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы (G6PDH). Фер — мент G6PDH активен в растущих ооцитах, однако, в завершивших ста — дию роста клетках снижает свою активность [3]. BСB – тест основан на способности G6PDH конвертировать окраску BСB из голубой в бесцветную в растущих ооцитах, а в цитоплазме завершивших стадию роста ооцитах BСB не теряет цвет.

Цель работы – провести мониторинг растущих и завершивших фа- зу роста донорских ооцитов с учетом параметров ядерно-цитоплазма — тического и характера ооцит-кумулюсных взаимодействий.

Материал и методика исследований. Материалом для экспери- ментов служили ооцит-кумулюсные комплексы из антральных фолли — кулов свиней породы ландрас, убитых на мясокомбинате «Самсон» (Санкт-Петербург). Яичники без видимых признаков патологии, нахо — дящиеся на стадии фолликулярного роста или с развитым желтым те — лом, доставляли в лабораторию в термосе при температуре 35 С в те — чение 1,5–2 ч после овариоэктомии. Ооцит-кумулюсные комплексы (ОКК) выделяли из фолликулов яичников аспирацией с помощью шприца с иглой или рассечением стенки фолликула, затем промывали

3 раза в среде ТС-199 («Sigma», США), содержащей 5 мкг/мл гепарина и 50 мкг/мл гентамицина. В экспериментах использовали ооциты, вы- деленные из фолликулов 3–5 мм, окруженные не менее чем 5–6 слоями кумулюсных клеток, с гомогенной ооплазмой и равномерной по ши — рине зоной пеллюцида. Стенки фолликулов получали из яичников по — сле их кратковременной санации 70 %-ным спиртом с использованием ножниц. Фолликулярную жидкость аспирировали из фолликулов диа — метром 3–5 мм, с последующим центрифугированием при 1900×g в те — чение 30 минут. Фолликулярную жидкость фильтровали через фильтр диаметром 1,2–1 мм и инактивировали при температуре 56 ºC в тече-

XIX Международная научно-практическая конференция

Жодино – Горки

ние 30 минут. Для проведения ВСВ-теста ооцит-кумулюсные комплек — сы подвергали воздействию ВСВ (B-5388, Sigma) в концентрации 13 mM и экспозиции 60 минут. По истечении времени воздействия ВСВ ооцит-кумулюсные комплексы разделяли визуально на две группы: ооциты с голубой окраской цитоплазмы, завершившие фазу роста – ВСВ(+) и неокрашенные ооциты без голубой окраски цитоплазмы, растущие – ВСВ(−). Режим экстракорпорального созревания ооцитов, их оплодотворения и культивирования эмбрионов соответствовал ме — тодам, разработанным в лаборатории биологии развития ГНУ «ВНИ — ИГРЖ РАСХН» [4]. Средой для культивирования служила NCSU 23, в которую добавляли 10 М. Е. хорионического гонадотропина человека,

10 М. Е. хорионического гонадотропина лошади, 10 % фолликулярной жидкости (диаметр фолликулов 3–5 мм) и стенки фолликулов (диаметр фолликулов 3–5 мм). Статус хроматина ооцитов, кумулюсных клеток и эмбрионов оценивали по методу Tarkowsky [5].

Для сравнения результатов, полученных в опытных и контрольных группах, использовали критерий χ2, данные обрабатывали с помощью статистической программы «Sigma Stat». Достоверность различия сравниваемых средних значений оценивали при трех уровнях значи — мости: P<0,05; P<0,01; P<0,001.

Результаты исследований. Ранее нами показано, что выход эм- брионов из ооцитов свиней, завершивших фазу роста – ВСВ(+), значи — тельно превышает таковой при использовании ВСВ(−) – растущих ооцитов [6]. Для выяснения причин выявленного эффекта проведена серия экспериментов по сравнительной оценке статуса хроматина в кумулюсе, ооцитах и эмбрионах. Рост ооцита и формирование зрелой яйцеклетки в организме – комплексный процесс преобразования хро — матина и структурно-функциональных изменений ооплазмы и клеточ — ных органелл. Созревание ооцитов in vitro проходит в тесном взаимо- действии с окружающими их клетками кумулюса. В связи с этим осо — бый интерес представляет сравнительный анализ статуса хроматина кумулюса и ооцитов. Мы оценивали следующие параметры: степень экспансии; уровень пикнозов и митозов в клетках кумулюса; процент ооцитов, достигших стадии метафазы-II и число дегенерированных яйцеклеток. Обнаружено, что ВСВ(+) ооциты после 44 часов культи — вирования имеют достоверно большую долю клеток кумулюса с высо — кой степенью экспансии по сравнению с ВСВ(−) ооцитами (95 против

50 % (P<0,01), табл. 1).

Cовременные тенденции и технологические инновации в свиноводстве

4–6 октября 2012 г.

Т а б л и ц а 1. Морфология кумулюса при культивировании ооцитов свиней

(время культивирования – 44 ч, число ооцитов – 176, число повторностей –3)

ВСВ-тест

Число

ОКК

Число ОКК с различной степенью

экспансии кумулюса, %

Высокая

Средняя

Низкая

ВСВ+

98

93(95)a

2(2)

3(3 %)

ВСВ

78

39(50)b

9(12)

30 (38)

Достоверность различия сравниваемых значений (критерий 2): a:bP<0,01.

Не обнаружено достоверных различий в уровне пикнозов и митозов в ооцитах, оцененных до культивирования как растущие и завершив — шие фазу роста после 44 ч культивирования (табл. 2). 86 % ооцитов, оцененных до культивирования как завершившие фазу роста, закончи — ли свое созревание. В группе растущих ооцитов этот показатель соста — вил 65 % (P<0,01). Ооциты (в процентах) с признаками дегенерации хроматина не имели достоверных различий в экспериментальных группах – 14 и 19 % (табл. 3). Данные по морфофункциональной оцен — ке эмбрионов свиней, полученных из растущих и завершивших фазу роста ооцитов, представлены в табл. 4. При визуальном анализе каче — ства эмбрионов учитывали следующие параметры: правильность фор — мы эмбриона; компактность; отклонение в размере клеток; цвет и структура эмбриона; наличие больших везикул; форма зоны пеллюци — да; наличие фрагментов клеток.

Т а б л и ц а 2. Статус хроматина в кумулюсе ооцитов свиней при культивировании в течение 44 ч (число ооцит-кумулюсных комплексов – 192, число повторностей – 3)

ВСВ-тест

Число

ОКК

Число кумулю — сных клеток

Характеристика хроматина в кумулюсе

n (%) клеток с пикно — тическими ядрами

n (%) митотических клеток

от общего числа с нормаль — ным хроматином

ВСВ+

101

10302

1241(12)

9061/553 (6)

ВСВ

91

9210

1013(11)

8197/574(7)

Т а б л и ц а 3. Созревание ооцитов свиней после 44 ч культивирования

(число ооцитов – 205, число повторностей – 4)

ВСВ-тест

Число

ооци-тов n

n (%) ооцитов, не

реинициировавших мейоз

n (%) ооцитов,

реинициировавших мейоз

n (%) ооцитов

на стадии ме — тафазы-II

n (%) дегене-рированных ооцитов

ВСВ+

107

8(7)

7(7)

92(86)a

15(14)

ВСВ

98

11(11)

23(24)

64(65)b

19(19)

Достоверность различия сравниваемых значений (критерий 2): a:bP<0,01.

XIX Международная научно-практическая конференция

Жодино – Горки

Т а б л и ц а 4. Морфологическая характеристика 2–32 клеточных эмбрионов, полученных из ооцитов свиней in vitro (число эмбрионов – 98, число повторностей – 3)

ВСВ-тест

Число эмбри — онов

n (%) нарушений,

выявленных

при визуальной ха — рактеристике

n (%) нарушений,

выявленных при ци — тологическом анали — зе

Всего деге-нери — рованных n, %

ВСВ+

55

8(14)

2(4)

10(18)

ВСВ-

43

8(19)

2(5)

10(24)

Цитологический анализ проводили с учетом следующих показате- лей: фрагментация цитоплазмы; неполный набор хромосом в бласто — мерах; несоответствие числа бластомеров количеству ядер; эмбрионы с пикнотическими ядрами в бластомерах. В результате исследований не установлено достоверных различий по уровню дегенерированных эмбрионов в исследуемых группах, что предполагает возможность ис — пользования ооцитов, не завершивших фазу роста in vivo, в техноло — гии получения эмбрионов in vitro при разработке соответствующей модели экстракорпорального дозревания.

Заключение. В результате проведенных исследований установлен — но, что при культивировании ооцитов, завершивших рост in vivo, вы- ход созревших клеток значительно превысил таковой при культивиро — вании ооцитов, не завершивших фазу роста. На основе сравнительного анализа статуса хроматина завершивших фазу роста и растущих ооци — тов свиней после культивирования in vitro обоснована необходимость предварительной селекции на основе ВСВ-теста популяции донорских ооцитов, предназначенных для получения эмбрионов in vitro.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект офи-а 10-04-00389).

ЛИТЕРАТУРА

1. Production of cloned pigs from cultured fetal fibroblast cells / A. C. Boquest [et al.] // Biol Reprod. – 2002. – Vol. 66, № 5. – P. 1283–1287.

2. Transgenic swine for biomedicineand agriculture / R. S. Prather [et al.] // Theriogenolo-gy. – 2003. –Vol. 59. – P. 115–23.

3. Selection of prepubertal goat oocytes using the brilliant cresyl blue test / E. Rodriguez — Gonzalez [et al.] // Theriogenology. – 2002. – Vol. 57. – P. 1397–1409.

4. Методы получения эмбрионов свиней in vitro / Т. И. Кузьмина [и др.]. – СПб. – Пушкин, 2008. – 36 с.

5. T a r k o w s k i, A. An air-drying method for chromosomal preparation from mouse

eggs / A. Tarkowski // Cytogenetic. – 1966. – Vol. 1. – P. 394–400.

6. Селекция донорских ооцитов свиней на основе ВСВ-теста / Т. И. Кузьмина [и др.] // Генетика и селекция в животноводстве: вчера, сегодня, завтра: сб. науч. тр. – СПб. – Пушкин, 2010. – С. 207–212.

Cовременные тенденции и технологические инновации в свиноводстве

4–6 октября 2012 г.

Материал взят из: Современные тенденции и технологические инновации в свиноводстве: матер. XIX Международной науч.-практ. конф Горки, 4–6 октября 2012 г.