АКТИВНЫЕ ФОРМЫ КИСЛОРОДА В РЕГУЛЯЦИИ СОКРАТИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ГЛАДКОМЫШЕЧНЫХ КЛЕТОК

Л. В. Смаглий, А. С. Желудева, С. В. Гусакова

ГОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России (г. Томск)


 

 

 

К активным формах кислорода (АФК) относят широкий класс кислородных соединений ради кальной и нерадикальной природы (супероксиданион радикал О2 , гидроперекисный радикал НО2 , гидроксильный радикал НО, синглетный кислород 1О2, пероксид водорода Н2О2, гипохло рит – OCl, радикал NO NO ) [3]. Содержание кислородных радикалов в клетке может увеличивать ся, если повышается скорость образования АФК или снижается способность ферментативных систем к их нейтрализации. Стойкое увеличение в клетках уровня свободнорадикальных соединений приво дит к развитию окислительного стресса (ОС) [1].

Одним из важнейших элементов редокссистемы клеток являются супероксид анион и оксид азота (NO). Вопрос о том, являются ли они вторичными посредниками или модуляторами оперирования «классических» вторичных мессенджеров остается открытым. Известно, что основные эффекты

влияния ОС на функциональные свойства клеток, в частности на сократительную активность мышеч ных клеток, связаны с увеличением концентрации АФК.

Объектом исследования явились изолированные сегменты грудного отдела аорты беспородных

белых крыс, которые являются традиционной моделью артериального сосуда мышечного типа. После выделения аорту помещали в физиологически сбалансированный солевой раствор Кребса, с помо щью хирургических ножниц отпрепаровывали жировую и соединительную ткань и выделяли сегмен ты шириной 23 мм. Эндотелий удаляли механически, вращением деревянного шпателя в просвете сегмента в течение 1 минуты непосредственно перед выполнением эксперимента.

Для исследования сократительной активности гладких мышц использовался метод механогра фии. После предварительной нагрузки 500 мг сегменты фиксировались в термостатируемой перфузи онной камере в условиях постоянной перфузии раствором Кребса (1мл/мин). Измерение механиче ского напряжения ГМК проводилось с использованием сертифицированной четырехканальной меха нографической установки Myobath II и аппаратнопрограммного комплекса LABTRAX4/16 (Герма ния).

Амплитуду контрольных (100%) сократительных ответов сосудистых сегментов на действие гиперкалиевого раствора (замена 30 мM NaCl на KCl) или фенилэфрина (10 мкМ) регистрировали

после 4050 минут выдерживания в нормальном растворе Кребса.

Физиологический раствор Кребса содержал (в мM): 120.4 NaCl, 5.9 KCl, 2.5 CaCl2, 1.2 MgCl2,

5.5 глюкозы, 15 C4H11O3N [tris(oxymethyl)aminometan] (316.4 мосМ), рН раствора 7.357.40, температура 37±0.1С˚.

Используемые реактивы: перекись водорода (Россия), фенилэфрин, нитропруссид натрия, ме тиленовый синий (все Sigma).

Анализ данных проводили при помощи программы Statistica 6.0 for Windows фирмы Statsoft.

Фактические данные представлены в виде «среднее ± ошибка среднего» (X±m). Для определения ха рактера распределения полученных данных использовали критерий нормальности Колмогорова Смирнова. Для проверки гипотезы об однородности двух независимых выборок использовался U критерий МаннаУитни (MannWhitney U test). Для проверки однородности парных или зависимых, выборок был использован Ткритерий Вилкоксона (Wilcoxon mached pairs test).

Для изучения влияния оксида азота был использован нитропруссид натрия (НП), который ши роко применяется в научных исследованиях как донор NO. НП (0.001 0.05 мкМ) не изменял исход ное механическое напряжение (МН), снижал величину как гиперкалиевого, так и фенилэфрин (ФЭ) индуцированного сокращений гладкомышечных клеток (ГМК) аорты, однако более сильный эффект наблюдался при ФЭиндуцированном сокращении. При гиперкалиевом сокращении расслабление близкое к полумаксимальному наблюдалось при добавлении 0.05 мкМ НП (58.4±4.1%, n=9, р<0.05), а при ФЭиндуцированном – при 0.005 мкМ НП (42.6±4.1%, n=6, р<0.05).

Предобработка гладкомышечных сегментов ингибитором гуанилатциклазы метиленовым си ним (10 мкМ, 30 мин.) достоверно уменьшала расслабляющее действие НП как на гиперкалиевые со

кращения (30 мМ KCl) ГМК, так и на ФЭиндуцированные. Так при гиперкалиевом предсокращении релаксирующее действие НП (0.05мкМ) составляло 27.2±1.8% (n=6, р<0.05), а при ФЭ индуцированном предсокращении расслабляющее влияние НП (0.005мкМ) составляло 15.7±2.3% (n=6, р<0.05) относительно контрольных значений.

Для определения влияния NO на сокращения, вызванные гиперосмотическим сжатием клеток, НП добавляли в модифицированный раствор Кребса, содержащий 150 мM сахарозы в качестве непроникающего осмолита (466.4 мосМ). Повышение осмолярности раствора приводило к развитию

воспроизводимого сокращения, амплитуда которого поддерживалась в течение 45 минут от начала аппликации. Амплитуда сокращения вызванного 150 мM сахарозы составляла 51.8±9.0% (n=6,

р<0.05) по сравнению с величиной контрольного гиперкалиевого сокращения.

После добавления 10 мкМ НП в гиперосмотический раствор амплитуда сокращения статисти чески значимо снижалась и составляла 26.3±4.7% (n=4, р<0.05) от контрольного гиперкалиевого со кращения.

Перфузия препаратов гипоосмотическим раствором (40 мМ NaCl) приводила к быстрому тран зиторному сокращению сегментов аорты крысы, амплитуда которого составляла 69.3±2.1% (n=7) по

сравнению с величиной гиперкалиевого сокращения. После добавления 10 мкМ НП в гипоосмотиче ский раствор амплитуда сокращения не изменялась.

Для получения изоосмотической стрикции сегменты аорты крысы экспонировали в гипоосмотической среде (40 мM NaCl) в течение 60 минут, затем возвращали их в нормоосмотический рас твор. Восстановление осмолярности раствора во всех случаях приводило к развитию транзиторного сокращения, амплитуда которого составляла 21.6±8.7% по сравнению с величиной гиперкалиевой контрактуры (n=5, р<0.05). После добавления 10 мкМ НП амплитуда сокращения при изоосмотиче ской стрикции снизилась до 8.9±3.1% (n=4, р<0.05) по сравнению с величиной контрольной гиперка лиевой контрактуU критерий МаннаУитни (MannWhitney U test). Для проверки однородности парных или зависимых, выборок был использован Ткритерий Вилкоксона (Wilcoxon mached pairs test).

Для изучения влияния оксида азота был использован нитропруссид натрия (НП), который ши роко применяется в научных исследованиях как донор NO. НП (0.001 0.05 мкМ) не изменял исход ное механическое напряжение (МН), снижал величину как гиперкалиевого, так и фенилэфрин (ФЭ) индуцированного сокращений гладкомышечных клеток (ГМК) аорты, однако более сильный эффект наблюдался при ФЭиндуцированном сокращении. При гиперкалиевом сокращении расслабление близкое к полумаксимальному наблюдалось при добавлении 0.05 мкМ НП (58.4±4.1%, n=9, р<0.05), а при ФЭиндуцированном – при 0.005 мкМ НП (42.6±4.1%, n=6, р<0.05).

Предобработка гладкомышечных сегментов ингибитором гуанилатциклазы метиленовым си ним (10 мкМ, 30 мин.) достоверно уменьшала расслабляющее действие НП как на гиперкалиевые со

кращения (30 мМ KCl) ГМК, так и на ФЭиндуцированные. Так при гиперкалиевом предсокращении релаксирующее действие НП (0.05мкМ) составляло 27.2±1.8% (n=6, р<0.05), а при ФЭ индуцированном предсокращении расслабляющее влияние НП (0.005мкМ) составляло 15.7±2.3% (n=6, р<0.05) относительно контрольных значений.

Для определения влияния NO на сокращения, вызванные гиперосмотическим сжатием клеток, НП добавляли в модифицированный раствор Кребса, содержащий 150 мM сахарозы в качестве непроникающего осмолита (466.4 мосМ). Повышение осмолярности раствора приводило к развитию

воспроизводимого сокращения, амплитуда которого поддерживалась в течение 45 минут от начала аппликации. Амплитуда сокращения вызванного 150 мM сахарозы составляла 51.8±9.0% (n=6,

р<0.05) по сравнению с величиной контрольного гиперкалиевого сокращения.

После добавления 10 мкМ НП в гиперосмотический раствор амплитуда сокращения статисти чески значимо снижалась и составляла 26.3±4.7% (n=4, р<0.05) от контрольного гиперкалиевого со кращения.

Перфузия препаратов гипоосмотическим раствором (40 мМ NaCl) приводила к быстрому тран зиторному сокращению сегментов аорты крысы, амплитуда которого составляла 69.3±2.1% (n=7) по

сравнению с величиной гиперкалиевого сокращения. После добавления 10 мкМ НП в гипоосмотиче ский раствор амплитуда сокращения не изменялась.

Для получения изоосмотической стрикции сегменты аорты крысы экспонировали в гипоосмотической среде (40 мM NaCl) в течение 60 минут, затем возвращали их в нормоосмотический рас твор. Восстановление осмолярности раствора во всех случаях приводило к развитию транзиторного сокращения, амплитуда которого составляла 21.6±8.7% по сравнению с величиной гиперкалиевой контрактуры (n=5, р<0.05). После добавления 10 мкМ НП амплитуда сокращения при изоосмотиче ской стрикции снизилась до 8.9±3.1% (n=4, р<0.05) по сравнению с величиной контрольной гиперка лиевой контрактуры.

Антагонистом NO является нейтрализующий его супероксидный радикал, также продуцируе мый эндотелием. Однако короткий период полураспада ограничивает роль супероксид аниона, как

важного паракринного регулятора в сосудах, тогда как его метаболит H2O2 – является наиболее ус тойчивым продуктом обмена кислорода в организме.

Перекись водорода (500 мкМ) не изменяла исходное МН, но вызывала дополнительное (на

25.2±3.8%, n=5, р<0,05) увеличение МН сегментов, предсокращенных гиперкалиевым раствором и, наоборот, уменьшала ФЭиндуцированное МН сегментов до 51.7±2.9% (n=7, р<0.05).

Увеличение наружной концентрации хлорида калия ведет к деполяризации мембраны ГМК, открыванию потенциалзависимых кальциевых каналов и сокращению, величина которого зависит от концентрации KCl. В ответ на эквимолярное замещение 60 и 120 мМ NaCl на KCl регистрировались сокращения сегментов аорты, амплитуда которых составила 129.1±6.8% и 145.5±13.6% (n=5, р<0.05). H2O2 вызывала дополнительное увеличение механического напряжения сегментов, предсокращенных гиперкалиевыми растворами (60 и 120 мМ KCl) на 25.4 ±7.7% и 26.3±2.3% (n=5, р<0.05), соответст венно, от контрольной гиперкалиевой контрактуры (30 мM KCl).

Прирост МН в ответ на действие ФЭ в условиях инактивационного выключения основных по тенциалзависимых механизмов входа ионов кальция обеспечивается открыванием рецепторуправляемых кальциевых каналов. Для изучения влияния Н2О2 на рецепторуправляемый вход ионов кальция ФЭ добавляли на фоне действия раствора, содержащего 120 мМ KCl. Фенилэфрин (10 мкМ) в присутствии 120 мМ KCl вызывал повышение МН до 197±19.8 (n=7, р<0.05) от контрольных значе ний. В этих условиях 500 мкМ Н2О2 не влияла на величину МН гладкомышечных сегментов.

Перекись водорода (500 мкМ) не влияла на гиперосмотическое сокращение (150 мM сахарозы)

и изоосмотическую стрикцию. Наоборот при добавления 500 мкМ перекиси водорода в гипоосмоти ческий раствор амплитуда сокращения статистически значимо увеличивалась и составляла 98.2±4.1% (n=7, р<0.05) от контрольного гиперкалиевого сокращения.

Продукция АФК связана как с осуществлением физиологических реакций, так и с повреждени ем тканей при патологических процессах, включая атеросклероз ишемическую болезнь сердца и др.

Как показали эксперименты, H2O2 потенциалнезависимо вызывает дополнительное увеличе ние механического напряжения сосудистых сегментов, вызванного деполяризацией мембраны ГМК гиперкалиевым раствором, но уменьшает сокращение, индуцированное фенилэфрином. Полученные данные указывают на то, что электромеханическая составляющая процессов сопряжения возбужде ниясокращения сосудистых ГМК активируется перекисью водорода. Проведенные исследования дают основания заключить, что расслабляющее влияние H2O2 на гладкие мышцы, предсокращенные α1адреномиметиком фенилэфрином, не связано с угнетением рецепторуправляемого входа ионов

кальция в ГМК. Расслабляющее действие H2O2 на фенилэфрин индуцированное сокращение прояв ляется только при субмаксимальных концентрациях кальция в клетке. Последнее позволяет допус кать угнетение перекисью водорода Скиназной ветви кальциевой сигнальной системы, обеспечи вающей поддерживаемое сокращение сосудистых гладких мышц и/или кальциевой десенситизации сократительного аппарата ГМК.

Монооксид азота является важнейшим и наиболее изученным газовым посредником, участ вующим во многих вне и внутриклеточных процессах. Именно с него, с момента открытия в 1986 году эндотелиального фактора релаксации сосудов, началось изучение нового класса сигнальных мо лекул, названных позднее газотрансмиттерами. Как показали проведенные исследования на гладко мышечных сегментах аорты крысы, расслабляющее действие NO на гиперкалиевое и фенилэфрин индуцированное сокращения, в своей большей части, опосредовано цГМФ.

В регуляцию разнообразных функций клеток, включая сокращение гладких мышц, пролифера цию, рост, программируемую гибель и некроз, вовлечен клеточный объем [4, 5]. Тонкие механизмы

связи объема клеток и регуляции их сократительной активности остаются малоизученными. Вместе с тем, показано, что модуляция объема клеток влияет на оперирование основных сигнальных систем

клеток, равно как и аппликация биологически важных веществ, активирующих сигнальные системы во многих случаях ведет к изменению объема клеток.

Донор NO нитропруссид натрия в отличие от Н2О2 вызывал снижение механического напряже ния при действии гиперосмотического раствора и изоосмотической стрикции, и не влиял на гипоос мотическое сокращение.

Полученные результаты свидетельствуют о существовании особой ветви регуляции сократи тельной активности сосудистых ГМК, включающей специфический объемзависимый ионный транс порт. Изменение объема клеток является своеобразным сигнальным механизмом, который может за пускать сокращение гладкомышечных клеток и модулировать возбуждающее действие физиологиче ски активных соединений и деполяризации мембраны.

Исследование выполнено в рамках реализации ФЦП «Научные и научнопедагогические кадры инновационной России» на 20092013 гг. ГК№ П445; ГК№ 02.740.11.5031 и ГК№ 14.740.11.0932.

Список литературы

1. Болдырев А. А. Карнозин и защита тканей от окислительного стресса / А. А. Болдырев. – М.: Издво ДиалогМГУ. – 1999. – 364 с.

3. Владимиров А. Ю. Кардиолипин активирует пероксидазную активность цитохрома c, потому что увеличивает доступность железа гема для Н2О2 / Ю. А. Владимиров, Е. В. Проскурнина, Д. Ю. Измайлов и др. // Биохимия. – 2006. – Т. 71, вып. 9. – С. 12251233.

4. Akar F. Contractile regulation of the Na+K+2Cl cotransporter in vascular smooth muscle / F.

Akar, G. Jiang, R. J. Paul, W. C. O’Neill // Am J Physiol Cell Physiol (United States). – 2001. –

281. – P. C57984.

5. Okada Y. Receptormediated control of regulatory volume decrease (RVD) and apoptotic vo lume decrease (AVD) / Y. Okada, E. Maeno, T. Shimizu, K. Dezaki et al. // J Physiol. – 2001. –

532(Pt 1). – P.316.

Заключение. Таким образом, использование окраски ЯОР может быть применено для оценки РБТЛ. Результаты, полученные при стимуляции культур ФГА могут свидетельствовать о подавлении Тклеточного иммунного ответа у больных в острый период ИКБ, особенно в случае эритемной и безэритемной серопозитивными форм заболевания.

Список литературы:

1. Шилов, Б. В. Компьютерный морфометрический анализ структуры ядер лимфоцитов перифери ческой крови человека в норме и при ЭпштейнБарр вирусной инфекции в условиях in vivo и in vitro : Автореф. дис. … канд. мед. наук / Б. В. Шилов. – Томск, 2001. – 16 с.

2. Howell, W. M. Controlled silver staining of nucleolus organizer regions with a protective colloidal de veloper: a one step method / W. M. Howell, D. A. Black // Experimentia. – 1980. – Vol. 36. – P. 101105.

3. Nuclear organizer regions in lymphomas a quantitative study / H. Yekeler, M. R. Ozercan, A. Z. Yumbul

et al. // Pathologica. – 1993. – Vol. 85. – P. 353360.

Материал взят из: Науки о человеке: Сборник статей по материалам XII Российского конгресса молодых ученых с международным участием (Томск, 26-27 мая 2011 г.)